银杏提取物真伪的快速鉴别

　　银杏叶有广泛生物活性，含有多种化学成分，主要包括黄酮类、萜类、多糖类、酚类、有机酸、生物碱、氨基酸、甾体化合物、微量元素等。其中，维生素C、维生素E、胡萝卜素以及钙、磷、硼、硒等矿物元素含量也十分丰富，但最主要 药用价值成分是黄酮类和萜类。黄酮类和萜类具有扩血管、抗氧化等多方面的作用。

　　银杏提取物(Ginkgo Biloba Extract，GBE)，指的是从银杏中提取的有效物质，含有银杏总黄酮，银杏内酯等物质。有扩张血管，保护血管内皮组织、调节血脂、保护低密度脂蛋白、抑制PAF(血小板激活因子)，抑制血栓形成、清除自由基等作用。大量的临床研究表明，银杏叶标准提取物可以大大的减少患者的精神疾病，如，阿兹海默氏症。

　　天然产物常常被认为可以天然的纠正和改善人们的健康系统。不幸的是竞争氛围导致最终市场上假冒伪劣产品的出现。银杏提取物中的有效活性成分为黄酮甙和帖类。这些成分在银杏标准提取物里的含量分别为≥24%和≥6%。目前普通的分析方法都有水解的步骤。这一水解步骤会将黄酮甙转化为甙元，而很多甙元在银杏原植物中是不存在的。而这些甙元如槲皮素、山奈酚、异鼠李素却用在了银杏产品的质量控制上，这些不合适的质量控制指标给银杏提取物的掺假提供了可乘之机。药典提供了一些复杂的分析方法，目的是规范化植物产品，包括原料，提取物和最终的植物商品。对于银杏的规定，美国药典，英国药典，欧洲药典，中国药典都有各自的检测方法，都要求银杏黄酮甙的含量在22.0%～27.0%之间。但是对于水解的银杏样品，各自药典对于液相检测甙元的峰比要求稍有不同。美国药典规定，山奈酚/槲皮素峰比为≥0.7，异鼠李素/槲皮素峰比为≥0.1。2010版药典规定山奈酚/槲皮素峰比为0.8～1.2，异鼠李素/槲皮素峰比为≥0.15。英国药典和欧洲药典对峰比没有规定，他们仅规定黄酮甙的含量在22.0%～27.0%之间，白果内酯含量在2.6%～3.2%之间，银杏内酯A,B，C的含量在2.8%～3.4%之间，并且银杏酸不超过5ppm。尽管美国药典，英国药典，欧洲药典，中国药典在银杏产品的质量控制方面提供了重要的规则，但是这些规定不能提供一种方法来分析有酸水解工艺的产品。有一个例外，中国医药保健品进出口商会提出，有水解工艺的银杏中，芦丁≤4%，槲皮素≤0.5%，山奈酚≤0.5%，异鼠李素≤0.2%，这里边同样规定了山奈酚/槲皮素峰比为≥0.7。美国药典在USP 37-2S增补版中增加了芦丁和槲皮素的规定，然而却对山奈酚和异鼠李素没有规定。尽管这些规定对市场上银杏的规范化起到了一定的作用，但是这些都不能很好的对有酸水解工艺产品中的甙元和其他成分进行监测。这些都导致了掺假银杏的泛滥。

　　银杏掺假常常有以下几种情况，最常见的一种掺假是加入特殊的原植物提取物或添加一定比例的黄酮甙和甙元来达到黄酮24%的要求。芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素是最常用的成分，另一种掺假是使用银杏的其他部位，如，根、皮或种子。

　　上面所提到到掺假中，用富含黄酮的其他原料是最常用的掺假。槐角和槐米就富含有芦丁和槲皮素，但是，同时含有染料木素和染料木甙，这两种成分在银杏提取物中是不含有的。如果用槐角或槐花掺假，就会在银杏提取物中检测到这两种成分。

　　银杏叶

　　银杏叶提取物

　　液相鉴别方法

　　1.溶液制备

　　对照品溶液：芦丁，槲皮素，山奈酚，异鼠李素，染料木素，染料木甙用甲醇配制成合适的浓度，这一浓度可以作为定量用。

　　样品溶液：银杏提取物的浓度为12mg/mL(甲醇)。银杏叶原料为100mg/mL(甲醇)。

　　1g银杏叶原料粉末用甲醇混匀后，悬浮液超声1小时。商品化的产品要经过换算成为120mg的提取物。对于商品化的胶囊和片剂，称样量要换算成相对于80mg的黄酮甙至10mL的容量瓶用甲醇超声140分钟。所有的样品进样前都要经过微孔滤膜过滤。

　　水解的样品是根据USP 37-NF 32来制备，和未水解的样品用同样的方法来分析。具体方法为：取银杏提取物0.3g至250mL圆底烧瓶中，加78mL混合溶剂(甲醇：盐酸：水=50:20:8;V/V/V)回流提取135分钟(液体变为深红色)，放凉至室温，转移至100mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀。取液体过微孔滤膜进行液相分析。

　　2.液相条件

　　安捷伦1200液相色谱仪。

　　Luna C18-HST色谱柱(2.7μm，3×100mm)

　　流动相 A:水 B:乙腈。流速1.0mL/min。

　　梯度洗脱：0-1.5min，15-15%B;3-4min，17-17%B;7-14min，20-35%B;

　　检测波长：260nm，360nm。

　　进样量：1μL

　　每个样品平衡5min。

　　槲皮素，山奈酚，异鼠李素的相对保留时间分别为1.00min;1.17min和1.20min。

　　3.液相图谱结果

　　图7为银杏叶原料，图28为银杏标准提取物

　　图8掺有芦丁，槲皮素，山奈酚和异鼠李素的银杏提取物

　　4.结果讨论

　　对于银杏叶提取物是否掺假，可以采用以下步骤进行判断：

　　用不水解的检测方法对样品检测

　　①如果样品中出现有13个甙元的峰，每个峰之间的峰高和原料基本接近，且无染料木甙、染料木素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素的峰，即可判断此样品为没有掺假;

　　②没有黄酮甙峰出现的样品，其首先判断为此银杏产品生产工艺采用的酸水解，但其需要满足芦丁≤4%，槲皮素≤0.5%，山奈酚≤0.5%，异鼠李素≤0.2%的要求，且无染料木素，染料木甙的峰，则可认定为有酸水解工艺的真的银杏提取物;

　　③用酸水解的方法对银杏样品进行检测;

　　④用山奈酚/槲皮素和异鼠李素/槲皮素峰的比值作为判断依据;

　　⑤不掺假的银杏提取物中，山奈酚/槲皮素峰比为0.8～1.2，异鼠李素/槲皮素峰比为≥0.15;

　　薄层鉴别方法

　　1.薄层鉴别条件

　　薄层板：硅胶G60，10×10cm。

　　样品制备：1.0g+10mL 70%乙醇，超声30分钟。

　　点样量：10µL。

　　展开剂：乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(100：11：11：26，V/V/V/V)。

　　展距：8cm。

　　检测：

　　先喷A试剂：二苯硼酸-2-氨基乙酯甲醇溶液(10g/L);

　　再喷B试剂：聚乙二醇400甲醇溶液(50g/L)后，略加热至斑点清晰，在366nm和可见光下检测。

　　2.薄层鉴别图谱

　　1.银杏提取物(掺假产品);2.银杏叶原料;3.银杏标准提取物(中检院);4~7.银杏提取物(掺假产品);8.槐角提取物;9.槐角(加酸水解);

　　3.结果讨论

　　从薄层图谱中可以看到，掺假的银杏提取物中会明显出现槐角水解物的特征斑点或者槐角的特征斑点。

　　小结

　　银杏提取物市场存在很多的掺假物，用液相和薄层的方法可以快速清楚的对银杏提取物的真假进行鉴别。

来源：实验与分析