HPLC的应用以及方法开发

　　据2004年数据统计，世界上化合物总数多达4700多万种;

　　在全部有机化合物中仅有20%左右的样品适用于GC分析;

　　而HPLC可对80%左右的有机化合物进行分离和分析;

　　HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备;

　　在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力;

　　HPLC的应用领域

　　1.在食品研究中的分析应用

　　食品中的天然成分

　　碳水化合物;

　　类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇;

　　脂肪酸和有机酸;

　　蛋白、肽、氨基酸;

　　食品添加剂

　　酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂;

　　抗氧化剂、防腐剂;

　　颜料和染料(色素);

　　维生素;

　　污染物

　　霉菌(黄曲霉毒素);

　　农药残留和兽药残留;

　　多环芳烃(PAHS)和亚硝酸;

　　2.在医药研究中分析应用

　　※药物分析有USP、BP、CP等标准：

　　常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。

　　甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。

　　抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。

　　中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类;

　　手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如，解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强)、医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。

　　在生物化学和生物工程中的应用：氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究;核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究;生物胺的分析研究(儿茶酚胺类);

　　在精细化工分析中的应用：醇、醛和酮、醚的分离分析;酸和酯的分离分析;表面活性剂的分析;聚合物的分析研究;药物、农药、染料、炸药等工业产品;

　　化妆品行业要控制和分析：防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等;

　　在公安、刑警破案工作需要：投毒药物、毒品分析等;

　　在环境污染分析中的应用：废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测;

　　在无机离子分析中应用：饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析;

　　方法开发的过程

　　1.想办法得到各种信息

　　向同行了解是否做过此类样品或是否有类似样品的分析方法;

　　查文献和方法，如，CA，AA，AOAC，EP;

　　仪器制造商的文献，如，Dionex，Waters;

　　2.对色谱柱有足够的了解

　　掌握分离机理，自己开发方法;

　　充分了解您自己的样品;

　　分析时要了解哪方面的情况?

　　灵敏度的要求有多高?

　　样品的本底是否很复杂?

　　有多少组份要分析?

　　对分析的精确度、准确度等有多高要求?

　　是否因是日常检验，而要求方法容易使用?

　　3.分离(制备)时要了解哪方面的情况?

　　要分离(即，制备)的样品量有多大?

　　要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?

　　是否需要保持生物活性?

　　对分离产物纯度的要求有多高?

　　纯度或活性的鉴定如何完成?

　　4.使用文献方法注意点。。。

　　5.色谱柱填料的种类、品牌是否相同?

　　6.注意文献方法的流动相;

　　7.注意色谱柱的规格：内径、柱长;

　　需要调整流速与进样量;

　　8.注意梯度条件;

　　9.了解系统的滞后体积(梯度);

　　具体操作步骤：

　　(一)选择HPLC检测器：

　　对样品有响应并有一个输出信号;

　　应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系并且所设计的校正技术应该促进这种关系;

　　但是：

　　由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象;

　　并不是所有的检测器是线性的;

　　受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距;

　　(二)用于HPLC的检测器：

　　没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离!

　　1.HPLC检测器可以分为：

　　溶质性质检测器(选择型)：

　　对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化(选择型);

　　整体性质检测器(通用型)：

　　不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应(通用型);

　　2.理想的HPLC检测器：

　　高灵敏度;

　　可忽略的基线噪音;

　　宽的线性范围;

　　独立于流动相及操作参数的响应;

　　对压力、温度及流速等变化不敏感;

　　长时间操作的稳定性;

　　低死体积;

　　非破坏性;

　　选择性;

　　(三)吸光度(V/Vis)检测

　　1.原理：

　　基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收;

　　2.定量基础：

　　比耳定律：A=KCL;

　　①优点：

　　1)对温度和流速不敏感;

　　2)可用于梯度洗脱;

　　3)灵敏度较高，ng级检测;

　　②缺点：

　　选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质;

　　3.应用

　　大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器;多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器(其中，50%以上是紫外/可见检测器，25%是PDA)。

　　背景吸收的影响

　　光电二极管矩阵(Photo Diode Array)

　　光电二极管矩阵检测器(PDA)的特点和用途

　　※一种三维水平的吸光度检测器——采集三维谱图;

　　※兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息：

　　在收集色谱图的同时，得到光谱图;

　　※提供许多有用的功能：

　　色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认;

　　可以发现单波长检测时未测到的峰;

　　任意波长的色谱再处理;

　　光谱信息—光谱库的建立检索和拟合;

　　※荧光(Fluorescence)检测原理：

　　原理：发荧光的化合物吸收光(UV或VIS)使其分子达到激发态，当其返回到基态时发射光的现象，即，荧光;

　　优点：荧光检测器灵敏度高，pg级检测;

　　缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生;

　　※荧光检测器的应用

　　环境中的污染物

　　多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等。。。

　　食品、饮料

　　食品中的毒素;例如，黄曲霉毒素;

　　染料;

　　维生素及衍生氨基酸;

　　生物技术及制药

　　（四.）示差折光(Refractive Index)检测

　　示差折光检测器(RI)是第一个商品化的液相色谱检测器(上世纪六十年代末、七十年代初)

　　通常被认为是一种通用检测器;

　　检测溶液中所有被溶解的溶质——非特异性;

　　任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值

　　1.原理：

　　连续测定流通池中溶液折射率来测定试样

　　各组分浓度。

　　优点：

　　通用型检测器

　　缺点：

　　1)对温度变化敏感;

　　2)不能用于梯度检测;

　　3)灵敏度低，μg级检测;

　　示差检测器的应用

　　示差折光检测器是通用型检测器，如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测;

　　特别适用于检测没有紫外吸收的化合物，例如，糖类、醇类、酯类以及脂肪酸等;

　　高分子化合物GPC，GFC分析以及复杂样品纯化;

　　结论

　　充分用已知样品结构确定以哪种方法开始

　　普通反相?离子抑制?离子对?还是其他

　　观察流动相条件改变时色谱峰的移动

　　根据变化的方向及大小决定下一步干什么

　　改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量

　　色谱柱的改变影响最大

　　梯度洗脱有利于复杂样品的分离

　　开发液相色谱方法的考虑因素

　　分离度是色谱分离中主要考虑的因素

　　※除分离度之外，在开发色谱方法时，以下几个因素也都要考虑：

　　灵敏度、载样量、分析速度、溶剂损耗、成本、容易使用、色谱柱寿命、效率

来源：实验与分析