质谱检测法与蛋白质分析

　　在生命科学研究工作中有一个重要问题，就是发现、鉴定蛋白质并弄清楚它们的一级结构。知道了蛋白质的氨基酸序列信息，我们就可以通过遗传密码将其与编码序列对应起来，从原则上来说，也就将细胞的生理学与遗传学联系起来了。发现、鉴定出了一个蛋白质就好像给我们打开了一扇窗，透过这个窗口，我们就能够对复杂的细胞调控网络有所了解。

　　在基因组学大步发展之前，我们就已经能够使用化学方法或酶学方法来鉴定蛋白质的一级结构了，不过当时只能对单一的、高度纯化的蛋白质进行分析。我们当时通常采用的方法都是检测紫外线吸光度(ultraviolet absorbance)或荧光光谱分析(fluorescent spectroscopy)的方法。比如用化学逐步降解法，即Edman法来鉴定时是从蛋白质多肽的N端逐步降解至C端，在降解的过程中通过检测紫外线吸光度的办法来辨认每一个被降解下来的氨基酸残基。不过在近20年里，有一种新方法——质谱检测法开始逐步进入到蛋白质鉴定领域。质谱法与化学法结合，为我们提供了更多有用的信息。随着质谱技术的进步，质谱法逐渐成为了蛋白质鉴定方面的首选方法。到了上世纪90年代中期，质谱检测法已经取代了Edman法，成为鉴定蛋白质一级结构的主流方法。

　　随着人类基因组项目的开展，大家对质谱技术的需求也变得越来越大。人类基因组项目让我们看到，我们可以对复杂的生物系统进行全面的高通量分析。而且人类基因组项目还向我们提供了大量的完整基因编码序列，这对于帮助我们大量、快速鉴定蛋白质序列来说意义重大。于是，继基因组项目之后，又迅速出现了蛋白质组学的概念，即对细胞或组织中的所有蛋白质进行系统研究。在蛋白质组学研究中，质谱技术同样是必不可少的一项重要技术。

　　不过要对“所有的”蛋白质进行分析实在是一项非常棘手的任务。虽然我们的技术在不断进步，但到目前为止，我们还不可能对任何一个物种的“所有”蛋白质进行分析。该任务最大的难点在于任何一个蛋白质组都非常复杂，而且我们对其复杂程度一无所知。我们所知道的是，任何一个物种蛋白质组组成单位(蛋白质)的数量都要远远超过其基因组中所有基因的数量。这是因为，一个基因可以通过可变剪接的方式、序列多态性方式、翻译后修饰方式以及其它蛋白质处理机制等形成多个蛋白质。而且，这些数量众多的蛋白质各自的浓度差别也非常大，目前没有一款仪器或者方法能够对动态范围如此大的样本群体进行分析。比如我们曾预计血清蛋白质的浓度差别可能超过了10个数量级。虽然分析血清蛋白这个任务也非常困难，但是这还是推动了蛋白质及蛋白质组学分析技术的发展。本文将向您介绍几种质谱检测技术，它们在蛋白质分析领域的应用情况，并对它们在蛋白质组学研究工作中的价值进行讨论。

　　质谱检测仪以及它们的应用范围

　　长期以来，质谱技术只能用来分析一些耐热的小化合物，因为我们当时还无法有效地、温和地使样品离子化，也无法有效地在不导致样品断裂的前提下将离子化的样品从固态转变成气态。在上世纪80年代末诞生了两项技术进步，即电喷射离子化技术(electrospray ionization, ESI)和基质辅助激光解析离子化技术(matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI)。这两项技术解决了生物大分子的离子化问题，它们的出现，极大地推动了质谱技术的发展，我们终于可以使用质谱技术来分析蛋白质组成问题了。随后又催生出了一大批新型的用于蛋白质和蛋白质组学研究领域的质谱检测仪，比如Q-Q-ToF质谱仪(Hybrid quadrupole time-of-flight instrument)和ToF-ToF质谱仪(tandem time-of-flight instrument)等(表1)。质谱仪不仅能够检测蛋白质多肽的分子量和氨基酸序列，还能发现蛋白质的结合位点以及翻译后修饰情况。在检测蛋白质多肽的分子量和氨基酸序列时，使用单级质谱仪(single-stage mass spectrometers)就足够了，而在发现蛋白质的结合位点以及翻译后修饰情况时除了进行单级质谱检测之外，还会选择特殊的离子通过碰撞对其进行裂解分析。在这种串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)检测试验中，我们可以通过对蛋白质裂解片段的分析获取详细的蛋白质结构信息。我们下面将要介绍的质谱仪都是在蛋白质研究中最常用到的仪器。这些质谱仪之间在物理原理、性能指标、操作模式以及应用范围方面各有差异。

　　表 1 各种常见质谱仪性能简介 ; 表中 √ 表示具有该功能，( √ )表示可选该功能。 + 、 ++ 和 +++ 分别表示可能或适度、好或很好、优秀或非常优秀 ; Seq 表示连续的。

　　飞行时间质谱仪和 hybrid ToF 质谱仪

　　在ToF质谱仪中，我们可以通过某个离子飞越一段长度真空管道的时间推算出它的质荷比(mass-to-charge ratio)。现在，ToF质谱仪的性能已经得到了很大的提升，尤其是在分辨率和准确性方面进步最为明显。现在，分辨力超过12，000已经是质谱仪的常规标准了。如果按照正确的操作规程，也可以达到百万分之一(ppm)级别的准确率。ToF质谱仪是进行ESI质谱和MALDI质谱检测的基础平台。Q-Q-ToF质谱仪在MS模式和MS/MS模式下就具有非常高的分辨率和准确率。在MS模式下，四级杆(quadrupole)起到了引导离子飞行的作用。而在MS/MS模式下，母离子(precursor ions)，即在ESI过程中产生的离子被“挑选”出来，进入第一对四级杆，而后在第二对四级杆中借助碰撞诱导解离作用(collision-induced dissociation)被裂解。然后，裂解离子产物经由ToF质谱仪进行分析处理。不论是完全扫描模式(full-scan)还是MS/MS模式，得到的质谱图都具有很高的准确率和分辨率，这也就意味着能获得更多的肽段信息，发现单一同位素信号(mono-isotopic signal)的离子状态和指派(assignment)信息。所有这些信息都给蛋白质鉴定工作带来了极大的便利。有了上述这些信息，再与数据库中的数据进行比对，就能找出检测蛋白质样品的资料。Q-Q-ToF质谱仪在定量分析方面以及蛋白质翻译后修饰情况分析方面的能力也同样出色。

　　MALDI技术是另一项非常有用的待测蛋白质样品离子化技术，通常都会将MALDI技术与ESI技术相互补充使用。MALDI质谱仪灵敏度非常高，同时，对样品污染(比如 ， 盐离子污染或少量去垢剂污染等) 的要求没有ESI质谱仪那么苛刻。最开始，MALDI技术是与ToF质谱仪联合使用用来检测蛋白质分子量的。后来又被应用到Q-Q-ToF质谱仪和ToF-ToF质谱仪上，这样才实现了真正的MS/MS检测。在单电荷(singly charged)母离子的质谱图和ToF-ToF质谱仪得到的质谱图中都能发现高能量的碰撞裂解片段，这些片段都是蛋白质多肽肽键断裂和侧链断裂形成的，这些信号都很容易被解析。

　　离子阱质谱仪( Ion trap ， IT )

　　在离子阱质谱仪中，可以捕获离子，因此也可以积累离子。离子阱技术具有无法比拟的高灵敏度和快速数据采集能力。将离子阱技术与数据依赖性采集技术(data-dependent acquisition)结合起来，我们就能进行高通量的质谱检测。不过，离子阱质谱仪的分辨率有限，捕获离子的能力不高，再加上空间电荷效应(space-charging effect)的影响，因此离子阱质谱仪的检测准确度不够高。改进型的线性离子阱质谱仪(linear ion trap analyzers, LIT)具有更高的离子捕获能力，更宽广的动态范围和更高的灵敏度。现在，线性离子阱质谱仪已经取代了传统的四级杆捕获设备。我们通常都会使用线性离子阱质谱仪中的慢速扫描功能来提高分辨率。离子阱质谱仪也都具有多阶段连续MS/MS功能，有了这种功能，我们能够反复分离、裂解某些离子片段，这是发现诸如磷酸化等翻译后修饰情况的好方法。

　　线性离子阱质谱仪技术已经被运用到三重四级杆质谱仪(triple quadrupole–type instrument)当中，这种新型的质谱仪具有了许多新的功能。Q-Q-LIT质谱仪就是这种三重四级杆质谱仪，它具有母离子扫描功能和中性丢失扫描功能，同时该质谱仪的敏感度也有所提高(图1B、C)。这些新型的质谱仪为我们提供了分析蛋白质翻译后修饰情况的“利器”。此外，Q-Q-LIT质谱仪具有的多重反应监测能力(multiple reaction monitoring, MRM)能够帮助我们发现母离子与某一片段之间的转换情况。将这种MRM技术与高效能循环(high duty cycle)结合起来，就能获得无与伦比的敏感性，并且能够进行定量分析。

　　Ion source：离子源;MS1：第一个质谱仪;CID：碰撞诱导解离;MS2: 第二个质谱仪;

　　Product ion scanning：离子产物扫描法;fixed:固定; scanning：扫描;m/z：质荷比;

　　Precursor ion scanning: 母离子扫描法;time：时间;

　　Neutral loss scanning: 中性丢失扫描法;Multiple ion monitoring: 多离子监测法;

　　图 1 各种串联质谱检测方法原理示意图。 A ：离子产物扫描法( Product ion scanning )是蛋白质组学研究里最常用的 MS/MS 质谱检测策略。该方法的目的就是要获得蛋白质片段离子的质谱图，然后据此鉴定出蛋白质的氨基酸序列。在本试验中，第一个质谱仪 MS1 是用来筛选出某一特定的母离子。随后，被选出的母离子在碰撞池中经由碰撞诱导解离作用( collision-induced dissociation, CID )被进一步裂解成更小的片段，然后这些小片段分子经由第二个质谱仪 MS2 进行分析、鉴定。对不同的母离子反复进行这种分析最终就可以获得蛋白质的完整氨基酸序列。 B ：母离子扫描法。在这里，第二个质谱仪 MS2 只对一个母离子进入检测。第一个质谱仪 MS1 对所有母离子进行扫描后挑选出一个母离子进入 MS2 。通常来说，该方法适用于检测某一样品中包含特殊功能基团的蛋白质亚群，这些基团包括磷酸酯基团或糖基化修饰基团等。 C ：性丢失扫描法( Neutral loss scanning )能够以同步的( synchronized )方式同时对两种待测样品进行分析。分子量不同的各种离子可以持续不断地通过 MS1 和 MS2 。在碰撞池中，不符合分子量要求的中性片段分子都被筛掉了。因此，该方法适用于分析样品中具有某种特定功能的多肽。该方法最常应用的领域是发现被磷酸化修饰的丝氨酸或苏氨酸位点。 D ：离子监测法( Multiple ion monitoring, RM )是由一系列的实验组成的。 MS1 和 MS2 会分别挑选出一母离子和一特定的能代表该母离子的片段分子。然后，经由一系列的实验转化操作(母离子 —— 小片段分子配对操作)，最后收集实验信号(色谱洗脱时间)以供结果分析。 MRM 方法适合对复杂样品中已知片段特性的特定样品进行分析。

　　离子回旋加速器与轨道离子阱质谱仪

　　随着功能强大的带有外部离子源的傅里叶变换-离子回旋加速器(FT-ICR)质谱仪的出现以及商业化，我们在质谱仪的分辨率与准确性方面取得了质的飞跃。有了这种新型的质谱仪，我们现在可以对ppm级乃至亚ppm级的样品进行分析了。该质谱仪的高分辨率特性不仅提高了数据结果的质量，同时也增加了峰容量(peak capacity)，因此相比传统的低分辨率质谱仪，FT-ICR质谱仪能够获取更多的信息。配有外部LIT设备的“杂交” FT-ICR质谱仪(hybrid FT-ICR instrument)的发展更是提高了该质谱仪的分析能力，同时也赋予传统的低分辨率MS/MS质谱仪更好的探测母离子的能力。将FT-MS质谱仪与LIT-ICR“杂交”质谱仪结合，就能获得真正意义上的平行全质谱检测仪(parallel full mass spectrum)MS1和串联(而非连续)质谱仪(tandem not sequential mass spectrum)MS2。高质量的MS1检测结果可以用于定量研究。这种策略唯一的缺点就是相对比较低的数据采集速度(平均每个循环只能获得几个数据)和IT设备造成的动态范围较窄。

　　最近，出现了一种新型的轨道离子阱(orbitrap)质谱仪。这是30年来上市的第一款使用最新物理技术的质谱仪，该质谱仪能分离振荡电场(oscillating electric field)中的离子。在分辨率和准确率方面轨道离子阱质谱仪与FT-ICR质谱仪不相上下，但是它不需要FT-ICR质谱仪使用的昂贵的超导磁铁(superconducting magnet)。

　　MS - MS 操作模式

　　串联质谱仪通常使用的都是离子模式来鉴定蛋白质的氨基酸序列(图1A)。目前所有的MS/MS质谱仪都具有该功能。不过表1中列举的其它特殊的质谱仪也具有MS/MS功能。如果要发现蛋白质中的某个功能基团则需要用到母离子扫描功能或者中性丢失扫描功能，而这就必须用到三重四级杆质谱仪，如，Q-Q-Q质谱仪，或四级杆离子阱质谱仪，如，Q-Q-LIT质谱仪。比如复杂混合物里的蛋白质磷酸化位点和糖基化位点就都可以用这种方法(在碰撞池中产生特殊的报告离子，通过它来进行特殊的功能检测) 检测出来。在一个典型的质谱检测试验中，首先先用母离子扫描或中性丢失扫描都能发现目标组分，然后再用传统的MS/MS方法鉴定蛋白质的氨基酸序列以及定位修饰位点。

　　三重四级杆质谱仪在MRM模式下也能以极高的敏感度进行定量分析。已知的或未知的分析物都以极高的敏感度和选择性能被定量检测出来(图1D)。这种高选择性得益于质谱仪能够对代表一个肽段的一对母离子和片段裂解物离子进行实时监测。而且，在MRM模式下进行的两轮选择过程会极大地提高检测的灵敏度，因为，第一轮筛选过后只能剩下很少的离子，这也就将背景噪声减小到了最低水平。碰撞诱导解离片段离子(collision-induced dissociation fragment ions，CID)来源于母离子，这些CID离子能够产生离散信号，而背景化学噪声信号则是随机分布的。最后，由于这种采样时间很长的技术固有的非扫描本质使得它的敏感度非常高，相比离子扫描技术的探测极限(LOD)要高出好几个数量级。

　　质谱仪的性能

　　我们已经在表1中对各种质谱仪的性能进行了一个概括。总体来说，质谱仪的性能包括分辨率、敏感度或探测极限和准确性等，这些性能都与质谱仪的类型、采用的离子化方法和扫描能力有关。不过没有哪一个仪器能同时在上述所有方面都全面占优，在选择仪器的时候必须根据实验需要进行相应的取舍。

　　对实验仪器性能的比较一直以来都是一个存在很多争议的话题。因为性能是服务于需求的，是取决于待测样品和实验步骤的。质谱仪对单独肽段样品进行检测时敏感度总是很低，不过如果生物样品的基质背景(matrix background)很高，那么检测的敏感度就会提高好几个数量级。这种同一款仪器在性能上表现出来的“不稳定性”其实很常见，在仪器处于不同操作条件或状态下时(比如 ， 在最优条件下，常规条件下和大批量处理条件下) 它们的性能表现都是不同的。实验目的是：想进行定量分析还是蛋白质鉴定，这也决定了该使用哪种仪器。在蛋白质鉴定试验中，仪器的分辨率(能很好地区分不同组分) 和准确性是最主要的，而在定量研究中，敏感度、动态范围和MRM能力才是最主要的。因此，我们应该根据实验目的的需要以及实验设计安排来确定该使用哪种质谱仪。

　　要想用全扫描模式(full scanmode)获取定量数据的同时再用MS/MS模式获取定性数据是一件非常困难的事情。不过某些“杂交”质谱仪，比如LIT-ICR质谱仪，由于它们能够平行采集数据，因此可以部分解决上面那个问题。精确的定量分析需要源自整个洗脱图(entire elution profile)的高质量的、高信噪比的数据信息。数据质量与数据采集参数高度相关，这些数据采集参数包括扫描时间或者采样时间(对于非扫描质谱仪而言)。因此，我们经常需要在数据质量和样品处理能力(量)之间做出取舍。

　　最新进展

　　最近又有几项有关质谱仪的最新进展问世，这些新成果的出现又给我们的生物大分子研究工作补充了“弹药”。在蛋白质测序方面，基于碰撞诱导裂解技术(CID)，又新出现了可变裂解技术(Alternate fragmentation technique)，该新技术是基于处在碰撞池中的离子具有的电子传递特性开发出来的。目前，电子捕获解离技术(ECD)和电子传递解离技术(ETD)都已经分别被应用到FT-ICR质谱仪和LIT质谱仪上了。运用这两种技术产生的蛋白质裂解产物能与经典的CID方法裂解产物互为补充。不过这两种新方法裂解更均匀，更适合用于发现翻译后修饰情况。ECD技术和ETD技术还都可以用于大型肽段和蛋白质的研究。他们的裂解能力和对完整蛋白的分析能力可以帮助我们直接用质谱仪对完整的蛋白质进行分析，即可以采用所谓的“自上而下(top-down)”的方法进行研究。这样，我们能够获得完整的氨基酸序列信息和翻译后修饰信息，能够对蛋白质进行最准确的鉴定。

　　传统的和最新的蛋白质组学研究策略

　　虽然到目前为止，还没有一种蛋白质组学研究策略能够对某个蛋白质组进行常规的、完整的分析，但是现在的技术已经非常强大，我们相信，很快就能进行全蛋白质组学研究了。而且，对某个亚蛋白质组(比如某个细胞器或亚细胞结构的蛋白质组)进行研究早就已经不是什么难题了，这已经成为了一种常规的研究手段。不过，蛋白质组学研究方法也需要视研究目的而做出相应的调整，不能千篇一律，比如，有很多研究都是描述性的研究项目，主要的关注点都着眼在发现、鉴定出蛋白质以及这些蛋白质的翻译后修饰情况，而最近又开始逐渐兴起蛋白质组学定量研究了。

　　实际上，每一个以质谱检测为基础的蛋白质组学研究工作都包括以下3大部分：(i)分离、消化蛋白质样品，然后对样品进行进一步裂解;(ii)对样品进行质谱定性和定量检测;(iii)用相应的软件对质谱检测结果进行分析处理，获得蛋白质的氨基酸序列，并且如果可能的话，进行定量分析。蛋白质的鉴定工作主要由MS-MS质谱仪负责，然后通过将质谱检测结果与数据库中的数据进行比对，最后确定出蛋白质的氨基酸序列。需要提醒的是，对结果的统计分析工作是保证结果正确性的关键。

　　对纯化蛋白进行质谱分析

　　下面，我们用最“古老”的蛋白质组学研究方法——2维凝胶电泳法(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)结合质谱分析法对纯化蛋白进行质谱分析的策略为例进行介绍(图2A)。首先，待测目标蛋白经消化、酶解之后经由质谱仪进行鉴定，通常使用的都是MALDI-ToF质谱仪来获取肽链指纹图谱(peptide mass fingerprint)。最近，出现了好几种该策略的改进方法，即将各种连续电泳分离方法(sequential electrophoretic separation method)或色谱分离方法(chromatographic separation method)结合进来，以提高质谱检测时的峰容量，这样就提高了对复杂样品的分辨率。定量分析则是在蛋白质水平通过比较不同样品中目标蛋白的信号强度来完成的。这种策略的优劣取决于它们区分相关(近)蛋白质的能力，即分辨率的高低，比如要能够区分出经不同类型修饰的蛋白质，还取决于待测样品的复杂程度。这种研究策略最大的问题是动态范围太窄，而且处理样品的能力也不够高，不具备高通量分析的功能，因此不足以进行蛋白质组学研究。而且，一些比较重要的蛋白质，比如膜蛋白等还不能用该方法进行分析，因为该方法只能用于分析复杂度比较低的样品，或者用于对某一特定蛋白进行分析的实验。

　　对复杂样品进行质谱检测

　　对复杂样品进行质谱检测时也用到了人类基因组研究项目中用到的“鸟枪法”策略。即首先将蛋白质组样品进行裂解，这样获得的多肽片段才能够用于自动化MS/MS分析，我们常用的是快速扫描设备如IT质谱仪(图2B)。用这种方法可以对完整细胞裂解物或组织提取物进行分析，也可以对亚细胞结构、提纯的细胞器或其它亚蛋白质组样品进行检测。

　　如果给待测样品带上稳定的同位素标记，我们就可以对样品中不同蛋白质的丰度进行检测了，这些蛋白质可能在化学性质方面是一样的，但是我们可以通过不同的同位素信号强度比对它们进行区分(图3A)。也可以使用如图3B中所示的串联标记(tandem mass tag)方法对样品进行多次质谱分析。还可以在进行质谱分析之前往待测样品中添加定量的同位素标记肽段，以获得样品准确的定量数据(图3C)。

　　这种“鸟枪法”最大的优势就是简单，不论从理论层面来说还是从实验操作层面来说都很简单，该方法相比前面所述的各种方法能够对蛋白质组分进行更大程度的覆盖，同时定量的准确性更高。不过该方法也有其局限性，具体表现在动态范围不够，难以使用生物信息学方法从大量的、高冗余的、复杂的蛋白质组样品质谱数据中推断出蛋白质序列。幸好这些问题已经部分得到了解决，通过裂解的方法可以降低样品的复杂程度。常用的裂解方法主要针对的都是蛋白质组中生物信息学资料丰富的部分，比如富含半胱氨酸的肽段、磷酸化的肽段、糖基化的肽段等等。这种“鸟枪法”策略最适合用于快速鉴定复杂样品中的组分，也非常适合用于对不同样品中同一蛋白质的定量比较研究。在“鸟枪法”策略中，在蛋白质水解过程里，不同肽段间的联系信息以及肽段与其来源蛋白质间的联系信息都已经丢失了，因此该方法不太适合用于对具有多重修饰的蛋白质进行鉴定工作。

　　Protein(s)：待测蛋白质样品;Enz. Digestion：酶解;Pep. Mixture：裂解产物混合物;

　　MS Analysis：质谱检测分析;DB Search：数据库比对搜索;Identities：鉴定;

　　Prot.DB ：蛋白质数据库;Proteome：蛋白质组;Sample prep：样品准备(裂解);

　　LC/MS& MS/MS：LC/MS以及 MS/MS分析;Quantification：定量研究;

　　Abundances：丰度;List of targets：挑选出待测样品;Pep.lib：待测靶样品;

　　图 2 蛋白质组学研究策略示意图。 A ：经由 2 维电泳或 pull-down 实验发现的待测蛋白质样品 prot 随即被酶解，然后用质谱仪对酶解片段 pep 进行质谱检测分析。最后根据肽质指纹图谱( PMF )鉴定出肽段以及它们的来源蛋白。其它的 MS/MS 数据也能用来进行肽段鉴定。 B ：随机蛋白质鉴定和定量分析方法，即鸟枪法。该方法可以对样品同时进行鉴定以及定量研究。被选出的肽段如图 1A 中所示，经过串联质谱仪进行离子扫描分析。在这里，母离子是被随机选出的，通常母离子的裂解片段中只有一个片段能够被检测到，也就是说存在采样不足的问题。 MS1 质谱仪采集到的离子强度信息与参考分子信息比对可以进行定量分析，这里使用的参考分子通常都会标记上稳定的同位素标签。 C ：定量研究方法能去除蛋白质定量研究与鉴定过程中的干扰信号。首先， MS1 质谱仪会通过比对不同样品的肽模式，即肽段分子量相对色谱保留时间作图的结果，挑选出不同样品间丰度不同的肽段。然后被挑出的肽段进入下一轮 MS/MS 质谱检测。 D ：基于各种假说的检测方法。该方法可以对各种预先被设定肽段的丰度进行高精度的检测，我们通常都是根据以往的实验结果来挑选这些靶肽段。在这里常用的方法是图 1D 中所示的 MRM 方法。如果在试验中选用合适的参考肽段会进一步提高实验的准确性。

　　比较模式分析

　　图2C中所示的比较模式分析法其实在原理上与2维电泳方法是相似的，就像在2维电泳中一样，每一个蛋白质都是一个独立的点，可以借此对它们进行定量和定性的分析。而且还可以进一步对蛋白质进行分析，比如进行蛋白质测序或进行翻译后修饰情况鉴定等。不过在以质谱检测手段为基础的分析方法中，蛋白质样品首先需要被降解、片段化，然后再用液相色谱-质谱仪LC/MS进行分析。借助色谱洗脱时间和分子量这两个参数，我们就可以鉴定出一个多肽离子。将所有离子的数量信息整合起来就得到了蛋白质的定量信息。这种方法主要的优势在于它可以对质谱仪发现的所有信息进行定量处理。与“鸟枪法”相比这是非常明显的优势，因为在“鸟枪法”里，只能对被鉴定出来的肽段进行定量化处理。不过在实际运用过程中，这种比较模式分析方法的重复性很差，也没有非常好的配套软件对检测结果进行分析。用这种方法可以获得一些数据，根据这些数据能够推测出蛋白质序列，这些数据包括质荷比(m/z)、带电荷状态、洗脱时间以及离子强度等。需要被测序的多肽(比如在两个样品中表达丰度不同的同一蛋白质)会出现在检测结果列表中，然后，我们会将该蛋白(多肽)进行新一轮的直接质谱检测，专门只采集它的MS/MS质谱图信息。这种研究方法也可用于MALDI/MS/MS质谱检测平台，因为蛋白质样品都被“固定”在样品板上，因此可以对它们进行不受时间限制的连续检测。

　　基于各种假说的研究策略

　　随着各种质谱仪技术的不断进步，我们有理由相信会出现敏感度更高、处理速度更快、更可靠的蛋白质组研究设备。不过目前我们还不清楚这些技术上的进步是否足以突破当下蛋白质组学研究工作中的瓶颈。以前我们曾认为蛋白质组学研究策略需要进行有效的变革才能全面、有力的对蛋白质组进行研究和分析。这种变革的核心就是改变以往那种在每一次试验中都对既往结果进行重复研究的蛋白质组学研究方法，新的研究策略是根据既往的研究成果来设计、指导进行新的实验研究项目。我们预计与人类基因组计划一样，将来也会获得某个物种的完整蛋白质组序列图谱，未来蛋白质组的研究目标应该是对蛋白质(多肽)进行具有特定目的的、非冗余的分析研究。对于质谱技术和质谱仪器的发展来说，这种研究策略的转变需要有更好的检测设备和检测手段(流程)做依托，要能够以更快的速度、更高的灵敏度和更强大的分析能力进行质谱检测。现在也出现了可供序列组装、修饰情况查询的数据库。可以预计，在不久的将来，各种生物学假说将会给我们设定出许多待检测的蛋白质靶标。我们可以将这些蛋白质的信息录入数据库，构成一个检测这些假说所必需的极小集蛋白质信息簇。然后，可以用各种方法，比如MRM方法对这些蛋白质进行检测(图2D)。因为这种研究方法主要是对非冗余靶标进行质谱检测，所以，在检测的敏感度方面和样品处理能力方面都有很大的提高。如果再配合定量的、标准化的同位素标记参考肽段，还可以进行精确的定量分析。

　　上述这种研究策略最适合用于Q-Q-LIT质谱仪这类被我们使用了几十年，主要用于检测小分子药品和体内药物代谢研究领域的三重四级杆质谱仪。在研究药物代谢时使用的研究方法同样适用于蛋白质组学研究领域。

　　作为上述方法的一个补充，Smith又开发出另一种使用精确分子量标签来鉴定蛋白质的方法。该方法首先测定待测物质的分子量，然后将数据与分子量数据库进行比对，以此来鉴定蛋白质。这样就无需再对每一个样品中的每一条多肽进行测序了。随着蛋白质组学研究的不断开展，我们积累的数据也越来越多，并且数据积累的速度也越来越快，同时，各种分析软件的功能也越来越强大，因此我们相信，基于各种假说的蛋白质组学研究策略一定会被更多的人所接受，所采用。

　　Labeling：标记 Tag：标记物 Peptide：肽段 Mixing：混合 Analysis：分析

　　MS：质谱检测 light：较轻的片段 heavy：较重的片段 Time：时间

　　Tandem mass tag：串联标签 MS/MS：MS/MS模式 m/z：质荷比

　　No labeling!：为标记 MRM：MRM方法

　　Internal standards(isotopically labeled peptides)：内参，即同位素标记的肽段

　　图 3 肽段定量分析策略示意图。 A ：同位素稀释法是进行肽段定量分析时最常用的一种方法，该方法也是进行蛋白质组学研究时常用的一个方法。该方法的原理是在一号样品所有的待测蛋白质上都带上一个稳定的同位素标签，同时在二号样品所有的待测蛋白质上都带上另一个稳定的同位素标签。这样，这两组样品就可以互为参照了。可以借助化学的方法，例如稳定的同位素编码标签试剂、代谢标记反应和酶标反应等对蛋白质进行同位素标记。 B ：使用串联标签进行定量研究。该方法同样需要各种稳定的同位素标记物。这些同位素标记物由两种同位素标记元素组成，它们都有固定的分子量。目前，这些试剂可用于四通道反应。通过在质谱仪的 MS/MS 模式下检测连接在蛋白质 N 端报告基团的相对强度以及 CID 图谱中低分子量范围里的信号可以获得待测蛋白质的定量信息。 C ：使用内参进行定量研究的方法。该方法实际上也是一种同位素稀释法。在该方法中会往待测样品中添加一种已知浓度的同位素标记的肽段，然后借助标准曲线进行精确的定量分析。虽然该方法样品制备过程较为复杂，但是它的前景非常光明。它非常适合用于基于各种假说的检测方法。

　　结论与展望

　　在过去的十年里，是蛋白质分析，更准确的说应该是蛋白质组学分析推动了质谱检测技术的发展。各种技术进步已经使质谱仪在准确度、分辨力、敏感度、定量分析能力等各方面都有了长足的进展，蛋白质组质谱检测策略方面也有了新突破。分析完整蛋白质、蛋白质复合体、低丰度蛋白质等各种样品的检测操作流程层出不穷。虽然这些质谱检测技术是为了满足蛋白质分析的需求而诞生的，但是它们出现之后又反过来推动了生物大分子(包括代谢产物、脂类物质、碳水化合物等等)领域的研究。因此，我们有理由相信，质谱检测技术必将在生物研究的各个领域里占有重要的一席之地。