关于HPLC的流动相，十个你不知道的“坑”

　　加入有机溶剂之后测量移动相酸碱度

　　校准pH计，得到水溶液的正确pH回读值——您要验证的缓冲液是含水的。如果你用有机添加剂测量pH值，得到的pH值会与添加有机溶剂之前的值不同。

　　然而，最重要的一点是要保持一致。如果你总是在加入有机溶剂之后测量pH值，那么务必保证在使用的方法中陈述你的步骤，这样的话其他人就会按照统一方式进行。这种方式并不保证百分百准确，但是至少可以保持方法的前后统一。这也许会比得到精准的pH值更加重要。

　　没有使用缓冲液

　　缓冲剂的作用就是用来控制Ph值并阻止其发生变化。很多其他方法会改变流动相的Ph值，会引起停留时间、峰形以及峰值响应的漂移。

　　甲酸、TFA等不是缓冲剂。

　　没有在正常酸碱度范围内使用缓冲液

　　每个缓冲盐有2个pH单位范围宽度，在这个范围内可以提供稳定性最佳的pH值。窗口之外的缓冲盐不具备有效的抗pH值变化能力。要么在正确的范围内使用缓冲剂，要么选择一种缓冲剂可以涵盖你所需要的pH值。

　　向有机溶液中加缓冲液

　　将缓冲溶液与有机相混合，会极有可能引起缓冲液沉淀。在很多情况下，即使沉淀现象已经发生了，但仍很难被发现。记住，一定要将有机溶液加入到水相当中，这可以很好的降低缓冲液沉淀的几率。

　　从0%用泵混合浓度梯度

　　现在使用的泵可以有效的混合流动相并实现在线脱气，但并不是使用你的方法的任何人都会配有高质量的泵。将A和B混合到一个单独的溶液中，在100%线上运行。

　　比如说通过用50ml水混合制备有机950ml起始混合物。这样做的好处就是可以减少HPLC之间的可变性，减少系统中产生气泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶体的预混合保留时间也为95:5。

　　不要使用正确的改性酸或改性碱改变缓冲液

　　只能使用形成你使用的缓冲盐的酸或碱。比如磷酸钠缓冲液应仅用磷酸或氢氧化钠调节。

　　没有在方法中阐述有关缓冲液的全部信息，比如说在1000ml的水中加入5g磷酸钠。

　　缓冲剂的类型决定了能够缓冲的Ph范围。所需的浓度决定了缓冲强度。5克或无水磷酸钠和5克一水合物磷酸一钠具有不同的缓冲强度。

　　还没先检查就开始添加有机溶液

　　如果上一个方法中基线B中使用过的是缓冲液，而你的方法中，基线B使用的是有机溶液，好在你可以沉淀泵管和泵头中的缓冲剂。

　　支起瓶体清空最后一滴

　　很有可能你没有足够的流动相完成整个操作，最后样品会冒烟的。除了可能存在烧干泵系统和柱子的可能性之外，流动相也会蒸发的一干二净，瓶体顶部的流动相会发生变化。

　　利用超声脱气的流动相

　　最重要的一点就是确保所有的缓冲盐已经溶解，但是这是一种效果最差的脱气方式，并且它会很快让流动相升温，从而引起有机成分蒸发掉。为了省去之后不必要的麻烦，请用五分钟时间使用真空过滤你的流动相。