食品中肉毒杆菌的检验方法浅析

　　肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的致病菌，全称肉毒梭状杆菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力。它在繁殖过程中所分泌的毒素具有极强的毒性，是氰化钾毒性的一万倍，是毒性最强的毒素之一。纯化结晶的肉毒杆菌毒素 1 mg 能杀死 2 亿只小鼠，对人的半致死量为 40 IU/kg。

　　肉毒杆菌毒素(Botulinum Toxin)前体是在肉毒杆菌细胞内产生的无毒化合物，肉毒杆菌死亡后无毒化合物释放出来，经肠道中的胰蛋白酶或细菌产生的蛋白酶激活后方始具有毒性。 肉毒杆菌毒素作用的机理是阻断神经末梢分泌能使肌肉收缩的乙酰胆碱，从而达到麻痹肌肉的效果。人们食入和吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，将会出现头晕、呼吸困难和肌肉乏力等症状。

　　新西兰乳制品巨头恒天然集团8月3日宣布，旗下部分婴儿奶粉和运动饮料等产品可能 “受到污染”，含有肉毒杆菌。多家食品厂商产品受到影响。RephiLe 技术人员根据《GB/T4789.12-2003食品中卫生微生物学检验肉毒杆菌及内毒素检验》和《SN/T 2525-2010 食品中肉毒梭菌的PCR 检测》总结出了对食品中肉毒杆菌进行初步检验的方法。

　　一、实验原理

　　将样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤 (TPGY)培养基培养，对培养物用 DNA 提取试剂盒抽提 DNA，进行 PCR 扩增，用琼脂糖凝胶电泳检验 PCR 产物中是否含有肉毒杆菌的的特征条带，从而初步判断食品是否被肉毒杆菌污染。

　　二、仪器和试剂

　　紫外检测仪 NanoDrop1000 (Eppendorf)，台式微量冷冻离心机 Microfuge 22R(Beckman Counter)，凝胶成像分析系统 Gel DocTM XR (Bio-RAD)， PCR仪 My Cycler (Bio-RAD)，Direct-Pure UP 超纯水系统(RephiLe)，核酸电泳仪 EPS100 (上海天能)。

　　细菌基因组 DNA 提取试剂盒(Axygen)，dNTP (Takara)

　　三、试验方法

　　1、样品制备和增菌培养

　　接种前，先将增菌培养基煮沸 10 ~ 15 min，以排除溶解于培养基中的氧，并迅速冷却，切勿摇动。每 15 ml 增菌肉汤中接种 1 ~ 2 g 固体食品或 1 ~2 ml 液体食品，接种时将接种物慢慢接入肉汤液面以下。每份样品接种两管庖肉培养基，置 35 ℃±1 ℃，同时接种两管 TPYG 培养基，置 28 ℃±1 ℃，厌氧培养 5 d。检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。若有生长，按步骤 2 分离纯化培养物。若未见生长，则继续培养 10 d。

　　2、分离纯培养物

　　取 1 ~ 2 ml 培养液置于无菌试管中，加入等量无菌无水乙醇，混匀，放置室温 1 h。用接种环取 1 ~ 2 环经处理过的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，35 ± 1 ℃ 下厌氧培养 48 h。接种可疑菌落到 TPGY 培养基，35 ± 1℃ 下厌氧培养 24 h。

　　3、DNA 模板制备及浓度测定

　　取1.4 ml TPGY 培养物转移到 1.5 ml 离心管中，14000 r/min 离心 2 min，弃去上清液。沉淀使用商品化细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取 DNA，按照试剂盒说明书进行操作。提取的 DNA 进行纯度和浓度测定后置于 -20 ℃ 保存。

　　4、PCR 扩增

　　采用分别针对 A、B、E、F 型肉毒梭菌肉毒毒素基因设计的型特异性引物(见附表1)，进行多个 PCR 扩增，每个 PCR 反应管检测一种类型的肉毒梭菌。PCR 反应体系和参数见附表 2 和表 3。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。PCR 检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用 A、B、E、F 型肉毒梭菌的基因组 DNA 作阳性对照，用非肉毒梭菌基因组 DNA 作阴性对照，用无菌超纯水作空白对照。

　　5、凝胶电泳检测 PCR 产物

　　用 0.5 X TBE Buffer 制备 1.2%~1.5% 的琼脂糖凝胶(凝胶加热融化后冷却至 60 ℃ 左右加入 EB 至 0.5 μg/ ml)，将 10 μL 的 PCR 产物与 2.0 μL 6 X 加样缓冲液混合，上样，最左边孔道加 DNA Marker。0.5 X TBE Buffer，10 V/cm 恒压电泳，根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时间，电泳检测结果用凝胶成像系统判读。

　　6、PCR 结果判定

　　阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为 PCR 结果阳性，按 GB/T4789.12-2003 进行确证试验。

　　待测样品未出现预期大小的扩增条带，判定 PCR 结果为阴性，直接报告结果。

　　实验中设置的阴性对照、空白对照和阳性对照 PCR 检测结果应符合上述情况，否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验。

　　表1　肉毒梭菌肉毒毒素基因 PCR 检测的引物序列

　　检测肉毒梭菌类型引物序列扩增长度/ bp

　　A 型正：5’-GTGATACAACAAGATGGTAGTTATAG-3’

　　反：5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’983

　　B 型正：5’-GAGATGCTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’

　　反：5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’492

　　E 型正：5’-CGAGGCGGTTGTCAACAATTTTAT-3’

　　反：5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’410

　　F 型正：5’-GCTTCATTAAAGACGGAAGCAGTGCT-3’

　　反：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’1137

　　表2　肉毒梭菌毒素 PCR 检测的反应体系

　　试剂终浓度加入体积/μL

　　10 X PCR Buffer1 X5.0

　　25 mmol/L MgCl22.5 mmol/L5.0

　　10 mmol/L dNTPs0.2 mmol/L1.0

　　10 μmol/L 正向引物0.5 μmol/L2.5

　　10 μmol/L 反向引物0.5 μmol/L2.5

　　5 U/μL Taq 酶0.05 U/μL0.5

　　DNA 模板-1.0

　　超纯水-32.5

　　总体积-50.0

　　注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。

　　表3　肉毒梭菌肉毒毒素基因 PCR 检测的反应参数

　　预变性扩增循环数后延伸

　　95℃，5 min94℃，1 min;

　　60℃，1 min;

　　72℃，1 min4072℃，1 min

　　注：PCR 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整

　　其他肉毒杆菌检测方法简介：

　　1、PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)

　　PCR-RFLP 的基本原理是用 PCR 扩增目的 DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的 DNA 片段条带。

　　2、16S rRNA 分析

　　不同种的真细菌与古细菌间的 16S rRNA 基因是高度保守的。它常被用于对各种生物物种进行研究。

　　在核酸检测中，水中的各种污染物尤其是核酸酶对检测结果有着非常大的影响。DNase 与 RNase 会降解核酸;酶活性的发挥需要离子浓度合适的缓冲液，特别是 Mg2+ 对 Taq 酶的活性起到决定性的作用;有机物会起到非竞争性抑制剂的作用;同时，细菌会持续地释放离子和小分子有机物，其基因被扩增也会对结果造成影响。

　　RephiLe 为用户特别推荐 Direct-Pure UP 超纯水一体机，该纯水仪以自来水为进水，同时制备反渗透 RO 水和高品质的超纯水，一机两水，以供不同需求客户的选择。终端可配置超滤过滤器，有效控制细菌< 0.1 cfu/ml，热原< 0.001 Eu/ml，满足生命科学实验的特别要求。

来源：实验与分析