多重PCR-基因芯片检测新研究

　　来自疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病诊断室的研究人员建立并初步评价了一种针对重要肠道病原菌的多重PCR基因芯片方法，这一方法具有较高的特异性，并且混合PCR可以分别按照种属内和种属间的引物组合方案用于多病原的筛检。

　　感染性腹泻在我国发病率居各类传染病之首，长期以来严重危害人民健康。其中绝大部分由细菌引起，具有发病急、传播快等特点，对其进行快速诊断以确定传染源是传染病防制工作面临的首要问题。目前在我国基层疾控单位大多沿用以培养生化鉴定为主的传统检测方法，繁琐耗时，已不能满足复杂多变的疫情处理工作。免疫学方法和细菌快速鉴定仪的使用在一定程度上缓解了这一情况，但由于缺乏特异性高质量好的诊断血清，而且受诊断菌种数量和通量的限制，仍不能进行快速准确的诊断。

　　为了解决这一问题，在这项研究中，研究人员采用多重PCR方法对重要的肠道病原菌包括致病性大肠、霍乱弧菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺氏菌、李斯特氏菌等的多个毒力进行扩增，评价了各菌属多重PCR的特异性，并以17对混合引物PCR初步评价了反应体系掺入荧光素对扩增效率和杂交效率的影响。

　　并且研究人员为传染病诊断芯片的靶基因标记提供合适的反应条件，为提高芯片检测通量，将引物数量增至35对，并对扩增中引物间的交叉反应进行评价，通过杂交结果筛选出合适的引物组合，从而建立起一套快速、灵敏、高通量、低成本、易于在基层单位推广使用的多重PCR基因芯片检测方法。

　　通过这些实验，研究人员发现了种属内引物混合均得到特异性扩增结果，种属间混合霍乱弧菌和空肠弯曲菌得到部分预期条带，随着混合引物数量的增加，交叉抑制现象也增多。杂交信号强度随多重PCR扩增效率的增加而增强。反应中掺入荧光素的扩增条带产量低于无荧光素的产物。可将35对混合引物拆成3个体系分别标记样品，以避免假阴性结果。

　　PCR反应中掺入荧光素降低扩增效率和杂交效率，但并不影响对杂交结果的判读和数据。基因芯片杂交信号强度取决于多重PCR的扩增效率。肠道病原菌多重PCR基因芯片检测方法具有较高的特异性，混合PCR可以分别按照种属内和种属间的引物组合方案用于多病原的筛检。该基因芯片检测可以采用3个引物体系完成样品标记。

　　优先扩增是多重PCR中的常见现象，原因是效率高的引物与其它引物竞争性地消耗掉大部分反应成分，导致效率低的引物扩增不出或产量下降，这项研究证明，存在优先扩增的多重PCR标记反应，其荧光标记产物经与基因芯片杂交后，杂交信号强度也相应不同，扩增产量低的标记产物杂交信号比产量高的弱。另一方面，这项研究发现随着引物混合数量的增多，非特异性扩增情况也相应增加，这种情况可能会导致假阳性杂交信号的产生，为减小这些影响我们对引物浓度、掺入扩增增强等方面优化条件，但并未发现有明显改善，因此认为主要取决于所选引物的扩增效率。

　　随着传染病诊断芯片检测病原范围的增加即混合引物数量的增加，引物间出现交叉反应的几率也增大，因此有必要通过更加严格的引物交叉反应排查试验找出合适的引物组合，从而避免产生假阳性或假阴性结果。

　　总体而言，这项研究表明，肠道病原菌多重PCR基因芯片检测体系具有较高的特异性，可根据杂交信号直观地判读样品中所含有的肠道致病菌的种类、型别、毒力、侵袭力，从而综合判断其致病情况，初步预测病原体可能的流行情况，在中病原体快速筛检、传染病预防控制等方面具有广阔的应用前景。

来源：实验与分析