DNA定量法比较--紫外-可见吸收光谱和荧光光谱优势比拼

对分子生物学家而言，DNA定量是一种重要而常规的技术。量化数据本身很少被当作实验的最终结果，更常见的是将其作为生物源提取物和下游使用、分析之间的桥梁。定量是重要的，但是，由于生物系统始终存在的变化，因此导致提取的DNA存在差异：不仅在数量上有差异，而且也与从原始来源及提取方法本身的污染水平有关。错误的浓度测量，容易导致下游应用过度或不足；或者因污染物的存在，抑制下游的分析。

DNA定量最常用的两种方法是紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法。对于纯化的DNA，采用紫外可见分光光度计测定样本在260nm的吸光度（A260）是应用最广泛的技术，其优点为快速、易于实现。荧光法则需要使用荧光探针，如Hoechst或PicoGreen荧光染料，当这些染料与DNA结合时，可以发出荧光。因为两种方法各具优点，因此在两者之间进行选择，应考虑工作流中的上游和下游步骤，再决定使用哪种技术进行检测。

图1. 使用纳米微滴2000分光光度计进行微量测定。A）低浓度样品，仪器自动选择一个长光程；B）高浓度样品，仪器会自动选择最佳的短光程精度。

浓度范围

荧光光谱和紫外光谱之间最重要的区别是可用浓度范围。以比色皿为基础的紫外-可见吸收光谱分光光度计，通常能够在大约0.4~75ng/μl范围内进行测量，而可变光程微量仪器如赛默飞世尔科技公司的微量紫外分光光度计NanoDrop 2000，不受固定光程比色皿的使用限制，可测量范围达到15000ng/μl。大多数实验室的样品，通常都在这些浓度范围之内。然而在某些情况下使用A260（如肿瘤活检等医学上的应用），则会因为浓度太低或样本纯度不够，无法进行精确的定量。

在这种情况下，可使用荧光光谱法测定，如应用赛默飞的微量荧光分光光度计NanoDrop 3300，可量化0.05~2000pg/μl之间的DNA样本。选择分光光度计时，最重要的考虑因素也许是仪器的动态范围（如图1所示）。可能需要使用不同光程的比色皿或配件，进行多次测量，或分析多个稀释样品。这样不仅浪费时间，也会对样品造成浪费。除非样本浓度是在配件的精确范围之内，否则无法提供准确的数据。

污染物检测

使用荧光分光仪，排除了污染物的检测；而使用分光光度计，通过比较260nm、280nm和230nm处的吸光度，更有利于DNA样品的纯度评估。如A260/A280和A260/A230的比值，建立起了良好的“确定样品纯度的方法”，前者表示蛋白质的污染水平，后者表示潜在的碳水化合物污染或提取过程中携带的化学物质。

图2. 纯化的、未污染的DNA光谱（A），相同的DNA样本含有胍（B）和（C）苯酚。通常可分别在230nm和260nm处观察到光谱中的波谷和峰值波长的变化。

此外，对光谱形状的检查，尤其是波峰和波谷的波长可以进一步提供有关污染物的信息（如图2所示）。一些污染物表现出特定的光谱特征，如苯酚，在270nm处有很强的吸收峰。通常在260nm处出现的一个强的吸收峰，移位到接近270nm处的一个更高的波峰——如果出现此种情况，容易诊断酚污染。

特异性

所有核苷酸的光吸收峰都为260nm，因此分光光度计一般无法对双链DNA，单链DNA，RNA和未结合的核苷酸进行区分。为了精确地量化从生物样品中提取的DNA，要求DNA不能包含其他的核酸，或必须使用荧光分光仪。许多市售的DNA提取试剂盒，对DNA是高度选择性的，通常采用RNase酶去除RNA，并且通过适当的洗涤除去未结合的核苷酸。然而，一些DNA提取方法，特别是许多“自制”的方法，提取特异性较差，会导致出现DNA和RNA的混合物，在这种情况下，使用一个特定的荧光探针，无需进一步纯化就可实现量化。

速度

由于应用的技术有所不同，DNA定量的速度差异也很大。虽然许多仪器制造商强调一次只能进行单一的测量，但这往往具有一定的误导性。

考虑速度的同时，更应该考虑整个过程，包括很多步骤，如仪器的预热和软件的编制、上样、制备稀释样品、测量时间、样品清除、洗涤，数据输出和浓度计算等。传统的分光光度计通常需要预热期，使用比色皿、稀释和手工计算浓度，需要花费大量的时间。

图3. NanoDrop 2000体积小巧，节省了实验室的宝贵空间。

虽然后期研发的一些仪器不需要进行预热，为了最大限度的节省时间，需使用如纳米微滴用工具。A260的关键优势在于，使用紫外可见分光光度计可以直接测量样品。而应用荧光试剂，在测量前必须准备试剂，与样品混合，随后获得的标准曲线，实际上增加了完成DNA定量所需的时间。

标准曲线

紫外可见光谱依赖于DNA的吸光度，可以直接进行测量，而不需要准备仪器或样品。荧光分光光度计依赖于样品所用的荧光，不同批次的荧光团、设备、培养时间或温度，都会带来一定的差异。若采用标准曲线，则可以去除这些差异，因此在样品定量前，必须要测量标准曲线。

与标准曲线一样，标准本身必须是可靠的，通常需准备一系列稀释液。若降低标准，或样品以任何方式被污染，或稀释系列不是精心准备的，都将无法保证样品量化结果的正确性。

小结

当然，紫外-可见吸收光谱和荧光光谱法二者的优点同时存在的情况还是有的，比如下一代测序方案需要采用这两种技术去测量，以准确地量化DNA的特异性，以及通过检测样品光谱、评估污染物的存在。然而，对许多用户来说，采用其中一种量化的技术就足够了。刀御天元纯度较高的样品，紫外可见光谱法更为常用，主要是因为其速度和易用性；如果样品浓度很低或在样品中检测到RNA，就需要把额外的时间和精力用于荧光测量。