减免毒素检验中的动物实验

如今，药物制剂如肉毒杆菌Botox（瘦脸用）、Bocouture（除眉间纹用）或者Azzalure（眼表整容用）已在全球广泛用于面部整容治疗。其活性成分称之为肉毒杆菌神经毒素(BoNT) 的制剂，除应用于美容手术之外，还逐步进入更多的应用领域，包括针对斜视、肌肉痉挛或肩周炎等治疗中，还被准予用于治疗特殊的控制力丧失症。鉴于此，科研人员已将该毒素称为21 世纪的阿司匹林。

肉毒杆菌中毒

肉毒杆菌起初的名声并不好，20世纪初，肉毒杆菌神经毒素作为致命性食物中毒的原因而为世人知晓，即肉毒杆菌中毒。食品保存不当可能引起肉毒梭状芽孢杆菌的污染，尤其是在缺氧条件下制造的食品（如香肠罐头）可能产生细菌和肉毒杆菌神经毒素。食用受此污染的食品会引发严重的中毒症状，仅几毫克的剂量便能致死。如今，该毒素成为人类已知的毒性最强的物质。肉毒杆菌神经毒素的致命毒性要比其他任何天然毒素的毒性高100倍以上，比任何人工合成的化学毒剂的高5000倍以上。因此，为避免风险，相应的药物（如Botox) 的生产许可要受到严格的管控。

图1. 肉毒杆菌中毒机理示意图，运动神经元上的神经毒素。

用于批次控制的“鼠标”测试

为对每个制造批次毒素的毒性进行准确测定，大多数的制造商均会对含有肉毒杆菌神经毒素的药物制剂进行小鼠半数致死量实验法（Maus-LD50-Test)。在进行检验时，对实验动物注射不同稀释度的药物制剂。随后观察动物出现中毒的临床症状，并最迟于注射后96h内致死。Maus-LD50-Test的主管部门根据实验过程中受试动物所出现的痛苦状态，将其定位为最严重程度级别为3级（动物的最大痛苦程度）。

由于全球对含有BoNT 药物制剂的需求日益增长，相应地就要进行更多的老鼠实验。此外，该实验还在医学诊断中广为推行，旨在用于验证肉毒杆菌中毒（如美国疾控中心CDC）。由于绝大多数制造商通常不公布相关数据，因此只能对实际的动物实验规模进行大致的估算。根据动物保护组织预计，每年用于实验的数量达600000。

为便于比较，2011年瑞士境内落户的所有制药企业和研究机构（不生产含BoNT药物制剂者）均进行了数量大致相同的动物实验（瑞士联邦兽医局）。

寻找替代方法

为遵照动物实验的3R原则，即改善、减量、取代原则，全球科研人员内正努力取代沿袭至今的动物实验法。如在与实验条件相适配的情况下，如何减轻受试动物的痛苦（改善refine）；改进计算和解释方法，旨在减少所需的实验动物的数量（减量reduce）。而最大的挑战则是要找到一种能彻底取代Maus-LD50-Test的方法。

然而，许多知名的不用动物实验进行检验的方法（取代replace)，都由于毒素的复杂生物功能而归于失败。毒素的作用主要体现在运动神经元上，通过释放出一定的信使物质，神经细胞指挥附件的肌肉细胞进行收缩。通过一种复杂的机理，毒素能够结合在运动神经元的细胞表皮上，还有一部分轻链会渗透到细胞内部。这些轻链又会在细胞内部裂解出特定蛋白质，而特定蛋白质通常能够参与运动神经元活性物质的释出（如图1 所示）。若不能消除该信使物质，附近的肌肉便不再收缩，从而导致瘫痪。动物实验或细胞培养实验均已保留有反应的复杂顺序。

本文旨在寻找一种检测系统，使之允许在尽可能接近实际条件下进行毒素的检测，同时又优于的细胞培养实验方法（如费力的护理和繁杂的实验）。为次，实验人员应用了脂质体人工膜。

图2. 经部分冷冻干燥过的脂质体薄膜的一种冷冻碎片的Kyro扫描电子显微镜摄像图。图中白色横条最大长度约200nm。

根据所用膜的组成成分，科研人员能够在一定程度上模拟某些细胞的种类。采用干脂类水化法制备相应的脂质体的膜。为此将其后在脂质体膜中所希望的脂类以及脂质受体溶解于有机溶剂中。将有机溶剂蒸发之后，就有脂类的薄层留于容积壁上，在容积壁上加相应的水溶液缓冲剂。

由于脂类只能溶于非极性液体而不溶于水溶液中，从而形成一种如牛奶般的白色乳浊液，该乳浊液系由亿万个极为不同的形状和大小的脂质体所组成。为了获得均匀一致的分布，再将脂质体通过一台压铸机压制成大约100nm的薄层（如图2 所示）。由于光线通过这些微小颗粒时不易折射，因此乳浊液看上去近乎透明。

检测脂质体

为了检测毒素不同的反应步骤，不仅脂质体膜设置相应的脂类，还集成相应的接受蛋白质于脂质体薄膜之中，蛋白质通常能够将毒素结合到运动神经元上。一旦毒素将受体结合到脂质体膜中，就会模拟如同发生在活体细胞中的过程，吸允周围环境的液体，借此毒素中的轻链就能渗透到脂质体的内部（如图3 所示）。由于该分裂仅发生在毒素有效结合、且在小的子单元转入到脂质体之后才能进行，于是通过对应的荧光信号检测便能显示出已进行的所有必要的生理反应。这就意味着借助于测量就能允许毒素的有效检测。

图3. 脂质体检验系统能够检测出的肉毒毒素3种最重要的生理功能。毒素在脂质体膜表面上与受体结合后，pH值发生改变，使毒素中的轻链（LC）渗透到脂质体的内部中去。轻链会分裂出特殊的肽基，借助于酶的分裂作用可读取在肽基上耦合的荧光分子。通过对荧光信号的量化，即可获得活性毒素分子的数量信息。

检测系统的进一步开发

当前该检测系统尚处于起步阶段，而相关的开发和优化工作已经启动，旨在使其成为可靠的检测方法，以便今后将其应用于含有BoNT的药物制剂的检测。一旦检测满足了审批当局的要求，就能够取代传统的老鼠半数致死量实验法。甚至在将来还可以将其扩展应用于具有类似作用的毒素的检测。

苏黎世联邦理工学院食品营养和健康研究所食品微生物教研室的Martin Lossner教授所领导的这一项目，得到两个德国研究小组的支持：即来自哥廷根的miprolab公司和来自汉诺威的toxogen公司，同时还得到了来自瑞士联邦人口保护局的Spiez实验室的支持。此外，该项目还得到瑞士3R研究基金会的赞助。