蛋白纯化的三种新工具

　　蛋白亲和标签是蛋白质组研究中的一个关键性工具。迄今为止，人们已经开发出了许多久经考验的蛋白标签系统，例如六聚组氨酸、HA、Myc和FLAG等等。尽管这些标签系统各具特色，但它们也分别存在着一些缺陷，还无法完全满足研究者们的需求。

　　为此，Biotechniques杂志盘点了近期出现的三种新蛋白标签系统，以便为研究者们提供更大的选择空间。这三种蛋白便签系统分别利用了高亲和力单抗、无机矿物基质以及能够剪切标签的金属离子。

　　单克隆抗体标签

　　日本研究者Yukinari Kato在开发胶质母细胞瘤的治疗性抗体时，无意中发现了一个可用作亲和标签的肽段。Podoplanin蛋白是一个在恶性癌细胞中高度表达的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠单克隆抗体NZ-1可以靶向该蛋白中一个14个残基的肽段。Kato在ELISA实验中注意到，NZ-1与Podoplanin蛋白的亲和力特别高，于是，他与大阪大学的Junichi Takagi合作，希望将其开发成为一个蛋白标签系统。

　　据介绍，这一系统的关键优势在于，可以在无损抗体柱的情况下很方便地进行再生。研究显示，高盐缓冲液可以完全去除结合在抗体上的PA标签，进行60次结合-洗脱-再生循环，也不会对柱子的结合能力产生任何影响。

　　目前，上述系统还不能兼容人类细胞。“我们正在晶体结构的引导下，设计不识别人类Podoplanin的改进版NZ-1，只保留它与标签肽段的高亲和力，”Takagi说。他现在正努力将这一标签系统应用到蛋白质组分析中去，希望能够用其替代FLAG标签。

　　磷灰石基质

　　人们常常用固化的抗体和金属离子来纯化重组蛋白，不过这些方案并不完美，存在着金属离子析出、稳定性低和成本高等问题。为此，Jacobs大学的Marcelo Fernandez-Lahore用无机矿物氟磷灰石，开发了一个新的亲和标签纯化系统。

　　Fernandez-Lahore实验室在这种材料的基础上，开始寻找与氟磷灰石高度亲和的标签肽段。研究人员通过噬菌体展示筛选，发现肽段KPRSVSG与CFT的结合能力很强，于是他们决定将这个CFT结合肽段(CBP)开发成为蛋白纯化的亲和标签。

　　研究人员指出，与使用固化抗体或金属离子的传统系统相比，CBP/CFT株组成的系统可以弥补一些缺陷，是蛋白亲和纯化的另一条宝贵途径。未来，研究人员将会用这一系统，对不同大小、不同特性、不同表达系统(例如哺乳动物或酵母表达系统)的蛋白进行测试。Fernandez-Lahore还指出，这一标签可以“实现可逆的固化，有望应用于医学诊断或细胞分析。”

　　二合一系统

　　尽管许多蛋白与亲和标签融合后也能够正常工作，但不少实验还是要求去除这些标签。人们往往将剪切位点设计在蛋白标签旁边，以便用蛋白酶消化时能够将其切下来。

　　为了进一步简化这一过程，哥本哈根大学的Niels ErikMøllegaard提出了一个有趣的新标签系统。在该系统中，一个分子可以同时实现亲和结合和蛋白标签的剪切，这个分子就是二价铀酰离子(UO22+)。

　　四年前研究团队发现，铀酰可以在蛋白中对磷酸化的丝氨酸进行光切割。研究人员随即想到，可以合成一个包含特异性磷酸化位点的标签，使其与固化的铀酰离子结合，该系统可以在光切割后释放出纯化的无标签重组蛋白。

　　现在，Møllegaard正在尝试对结合在铀酰-NTA-琼脂糖珠上的融合蛋白进行光切割，以便将其发展成为蛋白分离和标签切除的一步法系统。“还有许多步骤有待优化，举例来说，我们需要优化紫外线照射，以便在纯化柱上进行更有效的光切割，”Møllegaard指出。

来源：实验与分析