百思不得其解之“色谱双峰”

　　今天，小编主要针对其中的双峰情况和大家做下交流。色谱双峰指的是明明是同一种物质，但在色谱图中却呈现出双峰，让人误认为是含有二种物质。

　　在HPLC分析中，色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度)，峰型应对称而尖锐。但是，在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理时，会出现各种意想不到的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此。比如说色谱双峰的问题，这种情况大致可分为四种原因：

　　1 .色谱柱

　　如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现(出峰越快，双峰的可能性会减少)，尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题-保护柱污染或柱头固定相变脏或流失，或颗粒聚集在色谱柱的入口筛板上。如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。

　　如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。

　　2 .溶剂极性及进样量

　　许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的hplc的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前hplc分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样品进样量大，如定量管为20ul，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一样)，且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。这是上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

　　如果样品溶剂与流动相不溶或互溶性不好，当样品注入色谱分离体系中，会析出并接着再溶解的可能，这时相当于二次进样，也非常容易产生双峰。

　　3 .样品的特性及pH值

　　有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，甚至三峰.这时一般双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC-MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显.

　　pH对峰形的影响在缓冲液流动相平衡过程中非常明显，当连续进样时，受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外，在样品分析时，流动相的pH尽量远离被分析物的等电点，否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时，选择不好条件也会容易引起双峰的产生。

　　4 .仪器参数

　　记录的参数一般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的参数是不完全一致的，例如C-R3A数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms，HPLC 为5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。

　　还有一种情况是，参比波长设置错误，例如设置分析波长254nm，参比波长400nm，这个对于大多数化合物可能没影响。但是如果被测化合物，在400nm处也有强的紫外吸收，比254nm更高。这样其出峰时，由于背景的抵扣作用，本来一个峰会变成对称的二个峰，而且如果将二峰之间的峰谷反转180度，恰好是一个完整的峰。这时要将参比波长设置更大，或者取消。

　　HPLC (高效液相色谱法)技术发展至今，其应用范围已经涉及到多个领域：

　　1.环境分析中的应用：可应用于环芳烃、农药 残留分析等。

　　2.食品分析中的应用：可应用于食品营养成分分析、食品添加剂分析、食品污染物分析等。

　　3.生命科学中的应用：可在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学及生化领域的分子量物质纯化、分离和测定等。

　　4.医学检验中的应用：体液中代谢物测定、药代动力学研究、临床药物监测等的分析测定。

　　5.无机分析中的应用：阴、阳离子的分析等。

　　其最大的特点是可以分离不可挥发或受热后不稳定的有机物。且HPLC法色谱柱可以反复使用，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化，适用范围广( 样品不需气化，只需制成溶液即可)，定量分析方法的准确度高的特点，在《中国药典》中该法已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。它与气相色谱法配合使用，几乎可以承担绝大部分的有机物分离测试任务。

　　HPLC法应用如此广泛，几乎是每个实验室的必备基础分析仪器，实验分析员们最多操作的也是高相液相色谱仪，所以遇到问题可能也是最多的，那么，只要多多动手，多多思考，多多总结，日积月累，对于HPLC法你会变得更加游刃有余!