质粒提取的小技巧，请收藏!

　　实验室里经常听到这样的抱怨：实验没做好，实验没结果，心情郁闷。但其实静下心来查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到，以下是10个实验室日常小技巧。

　　主题：

　　关于质粒提取的小技巧

　　内容：

　　现在用质粒提取试剂盒非常方便，而且菌体培养后，可以多管浓缩提取，提到的质粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、转化等实验，可以提前跑个胶，只要不降解，就可以继续用，避免每次要用，都要培养一遍再提取一遍。

　　1.质粒DNA提取

　　提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。

　　将amp浓度提高到200μg/mL，下班前接种，次日一早收获菌体，此时OD虽然不高，质粒丰度却不一般。菌体量少些，操作体积(管数)也小(少)。

　　手提质粒，如果用氛氯仿和氯仿两步抽提，再注意一下手法，严格按照参考书上面的操作的话，提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差，我感觉好像还好一点，我就用过一次试剂盒，比较了之后不如我手提的好，以后再也没用过了。

　　2. Western Blot

　　做western blot的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。

　　做western blot转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。

　　器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干备用。

　　配胶最好现用现配，先配下层胶(分离胶)，后配上层胶(浓缩胶或积层胶)，而且在临灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入1～2次即可。

　　3. 缓冲液和培养基配置

　　(1)将缓冲液配方中的成分分别以10～100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可;

　　(2)配培养基时通常会忘记各成分的量，如，配LB时的三个成分不记得到底哪个是5 g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如，配LB时，在NaCl瓶外注明10g/L，yeast5g/L，tryton10g/L等，很方便，不需要每次配之前临时翻书。

　　4. PCR

　　在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100×主反应液(100次反应)，其中含buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分装或一管储存在-20度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：

　　(1)可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球;

　　(2)避免每次反应加样不均的可能;

　　(3)大大减少PCR假阳性的产生。

　　5. 酶切

　　如果是要做酶切，提质粒的最后一步最好是用水溶解DNA，因为，TE里面的离子会影响酶切的效率。双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后，再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：

　　(1)各反应成分均一;

　　(2)可大大减少限制型内切酶的使用;

　　(3)节省时间。

　　6.大肠杆菌转化实验

　　有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大(1~2毫米以上，BL21就长得快)，下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔(勿带出培养基)，50微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省6~8小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复。

　　转化时一定要做一个宿主菌的对照，即，重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板，以确定第二天长出来的克隆是否正确，我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于BL21可以在Amp(+)的平板上面生长。

　　7.蛋白质的表达、分离、纯化

　　当蛋白大量的表达时，包含体的形成几乎是不可避免的，而且很难通过改变一些诱导条件来改变，最有效的办法就是换表达系统，所以如果时间还充分的话，可以尝试一下，如果时间较短了，还是安心的座包含体蛋白的处理算了，而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到60%以上。

　　8. PCR扩增产物的克隆

　　引物设计主要是要注意以下几个事项：

　　(1)发夹结构;

　　(2)反向配对;

　　(3)GC含量(40～60%);

　　(4)退火温度(45～65度);

　　(5)引物长度(18～27bp);

　　(6)3'端最好是C、G(提高结合度);

　　(7)引物在序列中的错配位点;

　　※大致就这几个方面，重要性依次降低，由其是3'端绝对不能形成发夹结构。

　　那么你说你这段能不能设计引物呢?其实设计引物都只是好中选优的问题。

　　9.细胞冻存和复苏实验

　　(1)可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时，这样温度和pH值都已经最适合细胞生长了。

　　(2)为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了：稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。

　　(3)水浴温度40℃应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37℃。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。

　　10.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

　　(1)RT-PCR有两种做法

　　条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。

　　(2)RT-PCR应具备的条件

　　高质量的RNA(保留后可做5‘，3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。

　　(3)RACE

　　我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5’RACE是Gibico)，但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列(RACE的方法)，而另一个基因的3‘UTR却怎么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故。

　　附：移液器操作六部曲，别再犯这些小错误!

　　移液枪是实验操作上不可缺少的工具，对于顶尖高手而言，重要的就是实验的误差最小，重复再现性好，那就要注意正确移液枪使用，避免因小失大。

　　一.移液六部曲

　　1.装吸头

　　移液器套柄用力下压，需要时小幅度旋转即可。

　　错误操作：

　　用力敲击吸头。此方法会带来吸头损坏甚至移液器套柄磨损，从而影响其密封性。

　　2.量程设定

　　操作之前请先选择正确的移液器，移液器可在10～100%量程范围内操作，但在10%量程处操作对于移液技巧要求高，故推荐在35～100%量程范围内操作。

　　量程调节：

　　当由小量程调节至大量程时，朝所需量程方向连贯旋转，旋转到达超过所需量程1/3圈处再回调至所需量程。当由大量程调节至小量程时，直接连贯旋转至所需量程。

　　3.润洗

　　用同一样品重复吸液排液二至三次，润洗为以后每次吸液提供相同的接触面，保证操作的一致性。

　　注意：高温或者低温液体请不要润洗!

　　4.吸头浸入角度

　　吸液时尽量保持垂直状态，倾斜角度不能超过20°

　　5.吸头浸入深度

　　6.吸头浸入时间

　　吸液后在液面中保持一秒钟再将吸头平缓移开，这对于大容量移液器或者吸取粘性样品尤为重要。

　　7.吸液速度

　　匀速连贯移液，控制好移液速度，太快会造成喷液，液体或者气雾冲入移液器内部，污染活塞等部件。

　　8.排液及吹液

　　先将活塞按至第一档排液，略作停顿后按至第二档进行吹液。

　　排液四种方式：

　　9.手温

　　移液器不宜长时间握在手里，不用时最好将其挂在支架上或者挂在手上晾一下。

　　二.移液枪使用诀窍

　　1.影响移液枪精度因素

　　(1)温度：

　　室温低时，手温较高，使得空气膨胀，吸入冷溶液时往往发生误差;

　　(2)气密性：

　　tip和枪体的结合部，以及枪内柱体之间的长期磨损，造成误差;

　　(3)吸速：

　　容易造成tip内气泡产生，而且会污染枪头;

　　(4)试剂的挥发：

　　吸挥发性高的试剂时，蒸汽进入枪头，内压增高，结果在压出液体时，压力变大，而产生误差;

　　解决办法：

　　反复抽吸4～5次就可改善。

　　2.使用注意事项

　　(1)吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气;

　　(2)为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为，吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差;

　　(3)浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定;

　　(4)可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL蒸馏水20℃时重0.9982g;

　　(5)移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期操作会使内部零件松散而损坏移液器;

　　(6)移液器未装吸头时，切莫移液;

　　(7)在设置量程时，请注意，旋转到所需量程，数字清楚显示在窗中，所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程，否则，会卡住机械装置，损坏移液器。

　　(8)移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体(如，浓酸、浓碱、有机物等)。

　　(9)严禁使用移液器吹打混匀液体。

　　(10)不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影响准确度。同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作。

　　三.移液器错误操作及处理方法

　　做为液体操作中最常用的手动可调精密移液器，在使用过程中有些错误的操作会给操作本身带来误差，有些会造成机器的损坏等，在这里简单总结如下：

　　错误：装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧;

　　正确：插入吸头，左右轻转旋转上紧吸头;

　　分析：撞击会造成移液器内部齿轮组合的松动，长期操作会对移液器的精确性造成影响;

　　错误：吸头与移液器不匹配，影响气密性;正确选用与移液器匹配、有质量保证的吸头;

　　分析：吸头的不匹配，主要表现为对气密性的影响。会直接影响移液器的精确性，通常会移液操作会小于设定量;

　　错误：吸液时，移液器倾斜吸液;

　　正确：垂直吸液;

　　分析：倾斜的状态会造成气压面的改变。会对移液精度造成影响;

　　错误：吸头内含有未打出的液体时，移液器平置于桌面;

　　正确：将移液器垂直挂在移液器支架上;

　　分析：吸头内含有未打出液体，移液器平放之后液体有可能会流到移液器体内部，这会对移液器内部组件造成影响，严重的回造成损坏，较差污染等情况的发生;

　　错误：用大量程的移液器移取小体积的液体;

　　正确：移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度的要求;

　　分析：因为空气垫的存在，是造成移液器不准确度的主要原因。移液器的选择应该是最大量程，最接近目的液体转移量的选型原则;

　　错误：吸取具有强挥发性的液体;

　　正确：不建议用普通移液器做强挥发型液体转移;

　　分析：如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发，同时，建议使用外置活塞式移液器;

　　错误：吸液速度和放液速度过快;

　　正确：慢吸慢放;

　　分析：快吸对于1mL及以上量程的移液器，很容易造成液体上冲，过快的放液会增加液体的残留量。

来源：实验与分析