用高灵敏度LC/MS分析血液中药物小分子的诀窍

　　影响LC/MS实验结果的因素较多，那么在保证系统运行基础上如何保证高灵敏度的实验结果?本文将从两个方面来进行分析。

　　前言

　　随着生活水平的提高，人类的关注重心已经从温饱问题转移到更高的追求：精神水平的提升和个人生命的长度。增加人类寿命，势必要克服各种各样疾病的困扰。现代医学的研究重心在于尽早发现和精准治疗，表现为生命体中生物标记物(Biomarker)的浓度水平和治疗药物的代谢过程等研究。

　　目前，医院临床实验室中的特定诊断通常使用免疫检测和分子检测手段，交叉反应和干扰较为严重;作为替代手段，LC/MS基于色谱和质量选择性对化合物进行分离，灵敏度更高;可有效监控治疗药物，节省时间和成本。

　　影响LC/MS实验结果的因素较多，那么在保证系统运行基础上

　　如何保证高灵敏度的实验结果呢?

　　本文将从前处理和溶剂这两方面来考虑，下面请看详细说明。

第一方面：前处理

　　在LC/MS分析中，干扰物与分析物共流出，会影响液滴形成或引起共电离等问题，造成分析物离子化水平不稳定。

　　血液中磷脂类化合物是分析生物样品时，造成离子抑制的一个主要原因：

　　磷脂类化合物结构

　　传统的血液前处理方法，包括蛋白沉淀、液液萃取和固相萃取存在或多或少的局限性，如只能沉淀克级蛋白和与目标分析物共萃取等。

　　默克全新的固相萃取产品HybridSPE^®-Phosphorlipid，基于物理和化学作用，可同时有效去除血液中的蛋白和磷脂，提高液质检测的灵敏度。

　　HybridSPE^®产品

　　96孔板规格的HybridSPE进行“仿真沉淀”：

　　维生素D及相关代谢物的LC/MS实验

　　维生素D可以促进儿童骨骼增长，降低老年人骨质疏松等。维生素D缺陷，自发现以来，一直是研究重点。维生素D以两种形式存在：维生素D₂和维生素D₃，两者在肝脏中进行代谢。

　　其中25-羟基类代谢产物浓度水平，可用于维生素D相关疾病的诊断依据。最近研究表明，将非活性的3-epi维生素代谢产物与其他代谢产物分离开，更有助于疾病研究。采用LC/MS对代谢产物浓度研究的关键，在于血液中相关蛋白的去除。

　　维生素D及相关代谢物的结构和分子量信息

　　维生素D及相关代谢物在色谱柱Ascentis Express F5(150 x 2.1 mm, 2.7 µm)上的分离

　　维生素D及相关代谢物经不同前处理方法得到的回收数据对比

通过以上数据实验数据可看出，基于AscentisExpress F5色谱柱的选择性，可建立一个快速有效的LC/MS方法，用于体内维生素D代谢物的研究。采用HybridSPE^®，对血液样品进行处理，去除其中的磷脂和蛋白，可有效提高分析方法的重现性、稳定性和回收率。

　　第二方面：溶剂

　　溶剂等级不同，其所含有的杂质含量不同， LC-MS分析时会产生不同的基线背景和噪音，影响检测的灵敏度：

　　通过注射泵将两种不同级别的乙腈直接注射入MS系统

为保证高灵敏度的LC/MS分析，需采用高级别的溶剂，以利血平测试作为示例。

　　将利血平标准品通过注射泵注入MS系统，将所得的信号强度与背景噪音强度进行比较：

　　不同等级溶剂下得到的利血平LC/MS图谱

　　对利血平的分子离子峰的信噪比进行计算：

　　不同等级溶剂下得到的利血平分子离子峰信噪比值

利血平分子离子峰信噪比值结果表明，采用超梯度级的乙腈，所得到的信噪比值不仅高于梯度级乙腈得到的结果，而且明显高于其他两个品牌LC/MS溶剂测得的信噪比值。

　　结论

　　为保证高灵敏度的LC/MS分析结果，可从两方面着手：

　　1、前处理方面-采用HybridSPE®对样品中的磷脂和蛋白进行高效去除，可以为液质分析带来两个好处：

　　1)操作简便，节省LC-MS分析时间;

　　2)回收率高，结果重现性更好，更可靠。

　　2、溶剂方面-采用超梯度级的乙腈，可以降低LC/MS分析中的背景值，提高分析峰信噪比。

来源：实验与分析