作标准曲线是否真的那么简单?

　　分析检测中的标准曲线目的是可以根据标准曲线查出待测物质的含量。所以标曲的制定是实验室工作中必不可少的工作，那么，你所做的标曲真的做好了吗?RSD值、线性相关系数和线性方程如何?线性好与不好分别由于哪些原因造成的?是仪器、标液，还是配制的问题?对比下文的一些点来找找原因吧!

　　标准曲线的制作要求

　　按GB/T22554-2010《基于标准样品的线性校准》推荐：1、标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围;2、标准样品的组分尽量与被测样品组分一致;3、标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围;4、标准样品的个数至少应有3个浓度;5、每个标准点至少重复2次，这个重复是指从稀释开始;如果国家标准有相应的浓度系列推荐，尽量按国家标准，如果你要偷懒，比如我要减少标准点，至少要有理论标准支撑，比如至少要3个浓度。工作中我们经常采用线性校准，因为线性方程最为简洁。

　　标准曲线的作法

　　(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。

　　(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。

　　(3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度--浓度标准曲线。

　　①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ：2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。

　　在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各坐标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。

　　②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。

　　③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。

　　④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。

　　⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。

　　⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。

　　标准曲线的核心问题要解决

　　1、能找到确切浓度的标准物质或标准品。

　　2、标准系列和待测物质一定要有相同和一致的基体，因为样品基体可能会干扰仪器的响应，从这个意义上讲，样品的前处理实际就是提供标准和样品同样的基体环境，尽量祛除干扰基体。所以最好的标准系列应该是样品基体匹配的标准系列。

　　标准曲线的制作注意事项

　　对于分析定量来说，如果标线没有做好，那么即使前处理做的再好，回收率再好，也会使你的结论失去一定的参考价值!也失去了与其他人员测试数据的可比性!要做好定量工作除了仪器正常外，我们也要配制好一条好的标线：

　　1.首先尽量选取有证书的标准物质，不管是直接要用的母液还是要配置成母液的其他物质(如固体，粉末等)!选取有证书的标准物质是为了大家都有一个共同的基准(量值溯源)!如果实在是在没有有证书的母液条件下，就用有证书的其他物质来配置!如果有就最好用有证书的物质，因为自己配置的母液会带来一定的误差!

　　2.在配置时要把所有要用到的工具(容量瓶、移液枪、移液管等)进行校正，最好拿到国家计量中心或有资质的部门校正!有校正能力的实验室也可自己校正!

　　3.防止污染!要洗净所要用到的工具!对于离子色谱来说，主要使用去离子水清洗!

　　4.配制好标液后，及时上机，避免有的物质不稳定或易被污染!

　　但在常规实验室中也只有常规分析的时候，相对比较容易些，而现目前不少实验项目均要求检测ppb级含量的物质，IC是很容易引入污染的(Cl、Na等)。跨越几个数量级时，线性系数虽然很好，但是RSD值却很大，痕量分析的定量误差是相当的大。

　　5.选取合适的方程。根据物质的和检测器的特性，选取合适的线性方程。(比如是否要强制过原点，是直线还是二次方程等)

　　6.检查线性是否合格。除线性本身的一些参数：RSD值是否小于一定值比如(5%)，线性相关系数是否达到比如四个九以上，如果不是强行过原点的一次方程的节距是否合理等外，还要检查浓度的准确性，因为一定浓度的母液，按一定比例稀释都可成一定线性的，但浓度就不一定就是所需要的!所以光看线性好，是不能代表所做的标线就是合格的。

　　7.标线的准确性除仪器自身的回收率、响应值等相关外，另外我们可以做到：

　　⑴不同的人员配置标线和QC;

　　⑵防止母液是否有问题，要做标液的新旧对比或者不同的牌子的有证标准物质(参考物质)进行监控和或使用或次级标准物质(参考物质)开展内部质量控制;

　　⑶参加实验室间的比对或能力验证;

　　⑷使用相同或不同方法进行重复检测或校准;

　　⑸对存留物品进行再检测或再校准

　　8.标线合格后，还要通过QC等观察标线的使用寿命!

　　常见问题：

　　1.标准曲线需要人为的增加(0,0)点吗?

　　不能。通常的标准系列多是配制0,1,2,3mg/L系列这样的说法，没做实验人为添加(0,0)很不妥，因为很多时候0管进入仪器可能也有响应值，这也是我们考察试剂空白的一个重要步骤。这个0管在某些时候非常重要，比如全血铅测定，我们采用牛血清来基体匹配标准系列，如果此时你用酸做空白或没做实验人为添加(0,0)，那你就很难做好标准曲线。所以标准曲线的0管也是做好标准曲线的重要考虑点。

　　2 标准曲线需要减掉试剂空白来做吗?

　　不需要。仪器测出来标准系列的响应值可以减掉试剂空白或减掉0管的响应值来做，工作中我们也常用0管来做仪器调零。其实没有必要那么麻烦，即使空白或0管有响应值，在构建标准曲线时，我们已经认为该响应值就是0浓度，也就是扣除了这个空白的。

　　3 什么时候用Y=bX和二次曲线呢?

　　标准曲线我们通常采用的是Y=a+bX，曲线拟合完必须要做统计检验，且要做统计完备的线性检验和失拟检验，然后再做a与0的差别检验，如果a与0的统计学上无差异，你就可以考虑用Y=bX的拟合曲线，拟合出来后同样做线性检验和失拟检验，如果线性检验合格(P<0.05)且失拟检验合格(P>0.05)此时你就可以采用Y=bX。二次曲线的采用同样是这样的道理，如果你Y=a+bX时拟合不合格，你就考虑用Y=a+bX+cX2，同样做失拟检验，考察拟合的符合情况。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都满足拟合检验和失拟检验合格，则采用Y=a+bX形式，这样符合统计学上参数最少的统计简洁性原则。

　　4 标准曲线去查含量时是先减空白信号算样品含量还是先算出空白含量相减呢?

　　工作中我们常要减掉空白得到样品含量，现有国家标准方法有的推荐先算出空白含量，用样品含量相减，也有推荐先用样品信号减空白信号然后去标准曲线推算含量。而且这两种算法常常差距很大。其实这种差距往往是低含量水平时才出现，在低含量水平通过标准曲线推算含量时，本身不确定度就很大。这两种方法都可以。个人推荐先用样品信号减空白信号然后去标准曲线推算含量，因为这样出来的含量不确定度要小一些，而先算出空白含量再相减就增加了1次标准曲线推算含量时的不确定度，因为好的测量永远是不确定度小的测量。

　　附：标准曲线法和标准加入法区别?

　　标准曲线法：

　　也称外标法或直接比较法，是一种简便、快速的定量方法。与分光光度分析中的标准曲线法相似，首先用欲测组分的标准样品绘制标准曲线。

　　具体方法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准曲线，此标准曲线应是通过原点的直线。若标准曲线不通过原点，则说明存在系统误差。标准曲线的斜率即为绝对校正因子。

　　在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准曲线上直接查出注入色谱柱中样品组分的浓度。

　　标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。

　　标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件(检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等)很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品(或已知准确含量的样品)，而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。

　　标准加入法，又名标准增量法：

　　是一种被广泛使用的检验仪器准确度的测试方法。这种方法尤其适用于检验样品中是否存在干扰物质。

　　具体方法是：将一定量已知浓度的标准溶液加入待测样品中，测定加入前后样品的浓度。加入标准溶液后的浓度将比加入前的高，其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量。如果样品中存在干扰物质，则浓度的增加值将小于或大于理论值。

　　总的来说，标准曲线法适用于标准曲线的基体和样品的基体大致相同的情况，优点是速度快，缺点是当样品基体复杂时不正确。标准加入法可以有效克服上面所说的缺点，因为他是把样品和标准混在一起同时测定的，但他也有缺点就是速度很慢。标准曲线法可在样品很多的时候使用，先做出曲线，然后从曲线上找点，那样方便。标准加入法，适合数量 少的时候用。

来源：实验与分析