支原体PCR检测试剂盒的使用说明以及注意事项

　　1：样品准备：取1毫升细胞培养上清(贴壁和悬浮细胞都可以，最好已培养48小时以上)，在16000g离心5分钟，小心弃去上清，避免丢失沉淀(沉淀量有可能很少，目视看不到)。将沉淀用无菌PBS重悬，在16000g离心5分钟，同样小心弃去上清，如此反复用无菌PBS洗三次。最后将获得的沉淀用100微升超纯水重悬，置于100℃水浴中孵育5分钟。如此制备好的样品可在4℃保存1到2个月。

　　2：PCR反应的准备：

　　待各组份融化后先瞬时离心，然后轻弹混匀。按下表在已灭菌的PCR管中配制反应体系，每次实验需加一个阴性和一个阳性对照，测试反应管可以有多个。配制过程中应注意无菌，戴口罩，并注意避免操作产生的气溶胶造成样品间的交叉污染，推荐在有风压的设备如超净台或生物安全柜中进行操作。建议配制完毕后瞬时离心以使液体沉至管底。

　　3：PCR反应：

　　降落PCR法(Touchdown PCR)：94℃变性2分钟;首循环：94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸45秒;从第二到八个循环开始，每循环退火温度下降1℃，其余不变;从第九个循环开始，反应条件固定为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环32次;循环结束后，在72℃延伸7分钟，最后保持在4℃。

　　4：琼脂糖凝胶电泳：

　　按常规方法准备好2%琼脂糖凝胶，加入EB或Gold-View等用于显色。每份反应液取8微升，无须加入上样缓冲液，直接加入凝胶加样孔中，另留一孔加入DNA marker(要求在400-700bp区间有显示条带)，120伏电泳约30分钟。在紫外线下观察电泳结果，阳性对照应在643bp处有一条带，阴性对照无条带，检测条带在438-470bp区间。

　　1：组份A中含有染料，染料的加入不影响PCR反应，反应产物可直接电泳，节省时间。

　　2：本试剂盒检测范围涵盖支原体所有种属，真核细胞和革兰氏阴性菌不会造成干扰，与支原体亲缘关系较近的革兰氏阳性菌在反应中的灵敏度较支原体低1000-10000倍。

　　3：本试剂盒适用于检测支原体感染，客户如需区分感染的种属，可将PCR产物切胶然后测序，进行序列比对即可知种属类型。

　　4：有时可直接用细胞培养上清进行PCR反应。培养上清中常含有高浓度的PCR抑制剂，可能导致假阴性结果，故不建议使用此法。有些PCR抑制剂用离心可以除去，若离心不能去除，则推荐抽提基因组DNA进行PCR。而某些PCR抑制剂，如黑色素，通过抽提基因组DNA也不能去除，此时可以通过加入高浓度(如2%)的BSA(牛血清白蛋白)中和其抑制活性。

　　5：假阴性结果判断方法：在测试反应管中同时加入测试样品和阳性对照样品，观察对照条带是否出现。在阳性对照管出现对照条带的情况下，如果测试反应管的对照条带和检测条带都没有出现，则可判断为PCR反应受到了抑制，即假阴性结果。阳性对照管如果没有出现对照条带，请检查PCR条件是否恰当，或者与技术支持联系。

　　6：每个测试样品建议做两个反应：一个与阳性对照样品共同反应，排除假阴性结果，另一个单独反应，可避免因加入阳性对照样品所致的灵敏度降低。如果测试样品中支原体含量很高，可能会抑制阳性对照条带的出现。

来源：实验与分析