Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术

　　将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。

　　2 操作过程

　　SDS-PAGE电泳→转膜(PVDF或硝酸纤维素膜)

　　封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应

　　洗涤→显色或化学发光显影

　　Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8

　　and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.

　　Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.

　　3 注意的问题

　　(1) 蛋白质电泳

　　常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质

　　非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质

　　Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。

　　(2)转膜

　　戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致

　　以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15-30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。

　　方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极

　　排去滤纸、胶和膜间的气泡。

　　电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置

　　(3)封闭

　　用5%脱脂奶粉或3%BSA

　　(含0.1%Tween20 TBS或PBS配制)

　　时间：室温2h或4ºC过夜

　　(4)显色或显影

　　显色

　　辣根过氧化物酶：底物为DAB

　　碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT

　　化学发光显影

　　最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物(商品化产品)

　　注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定

　　(5)膜的再利用

　　化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping -2ME )Buffer洗涤后(洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2%SDS和100mm的 用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3-4次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交

　　二、ELISA

　　1 原理：

　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度(pg-ng/ml水平)，并且重复性好。

　　ELISA 常用的酶和底物

　　辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔黄色 ，检测波长492nm

　　TMB， 蓝绿色，检测波长450nm

　　碱性磷酸酶，底物为PNPP(对-消基苯磷酸酯), 黄色

　　检测波长405nm

　　ELISA各步骤的反应时间

　　包被：24-36h，蛋白浓度为1-5ug/ml

　　封闭：37ºC 2h 或4ºC过夜(3%BSA)

　　样本反应时间：37ºC 45min-1h

　　酶标抗体反应时间： 37ºC 45min-1h

　　显色时间：15min(避光)

　　设对照

　　可以一次包被多块板，冻存备用

　　2 类型

　　(1)间接法测抗体

　　间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。

　　常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。

　　(2) 双抗体夹心法测抗原

　　是检测抗原最常用的方法。

　　只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。

　　常用的组合：单克隆抗体+多克隆抗体

　　单克隆抗体+单克隆抗体

　　后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。

　　用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。

　　双抗体夹心法测抗原的方法：

　　捕获抗体包被→封闭(3%BSA)→待测抗原→洗涤(含0.1%Tween的PBS)→酶标单抗或多抗→洗涤→显色→检测

　　(3)竞争法测抗原

　　1)抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。

　　其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。

　　方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ELISA reader检测

　　2)抗原固相测抗原

　　其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。

　　方法:

　　a: 抗原包被96孔板; b:封闭;

　　c: 待测抗原与抗体反应一定时间; d: 加入96孔板

　　e: 洗涤 f：加入酶标二抗

　　g：洗涤 h：显色和检测

　　(4)IgM抗体的检测

　　1)间接法：

　　间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。 因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。