分析毒性植物毒素

2018-05-25 13:06:20

　　植物类蔬菜食品和饲料中可能自然含有毒物质吡咯里西啶生物碱(简称：PA);因此，专家建议在加工之前首先要检查其农用原材料及食品、饲料中PA的污染情况，而检查PA污染情况的方法首先可以是固相萃取(SPE)，然后，进行液相色谱-质谱联用(LC-MS)的检测分析。

　　在绿油油的牧场和田野中生长的不仅是健康的绿色，而且也有农户和牧马人的眼中钉、肉中刺——有毒的野生草本植物。不仅单指著名的豚草，同样包含俗称千里光的草本植物，类似于在欧洲分布很广的芝麻菜。

　　然而，与芝麻菜相比，豚草、千里光并不健康。豚草及其亲缘物种中含有吡咯里西啶生物碱PA，这是植物自身产生的、用于抵御掠食者的“武器”。

　　吡咯里西啶生物碱是一种天然毒素，已被证明具有损伤肝脏的副作用，有些还具有一定的遗传毒性与致癌作用;即便只误食了少量的吡咯里西啶生物碱也可以在牛马中观察到中毒现象;吡咯里西啶生物碱中毒可以导致严重的后果，包括：动物死亡。

污染检测

图1 美丽的外表往往具有欺骗性——草本千里光含有吡咯里西啶生物碱毒性物质，其下游产品具有损害肝脏的作用；该种毒物能够经食品和饲料等食物链进入人体内

　　污染检测

　　不难想象：商业领域中类似茶一类的饮品中，在茴香茶、洋甘菊花茶、草药茶、薄荷茶和柠檬香蜂草茶以及某些蜂蜜中都有可能含有吡咯里西啶生物碱，令人担忧。柏林联邦分析评估研究所BfR的分析评估报告得出的结论是：长期(慢性)摄入含有PA成分的食物(花草茶、路易波士茶、红茶和绿茶以及蜂蜜)，不仅对儿童，而且对成年人都有健康风险。联邦分析评估研究所BfR声称：食品生产厂家需要采取积极的措施减少食品中的吡咯里西啶生物碱的含量。

　　所遇到的挑战到底有多大?数据显示：自身能够产生吡咯里西啶生物碱的植物总数共计6000多种，占全球开花植物种类的3%，食品法和食品科学联合会的Birgit Christall博士表示：“联邦分析评估研究所BfR报道，在全球350多种植物中共检测出600多种不同的吡咯里西啶生物碱化合物及其N-氧化物。

　　Birgit Christall博士在近期2015年12月(第16届BfR消费者保护论坛)上发表的演讲中指出：没有采取百分之百、畜吡咯里西啶生物碱保护措施。

　　该实际情况表明：与药品不同，在目前的食品和饲料领域中并没有吡咯里西啶生物碱含量与限量的法律规定;“国际食品法典委员会”同样没有关于吡咯里西啶生物碱处理与释放量建议与“操作规范”。欧洲食品安全局EFSA目前也没有规定吡咯里西啶生物碱的每日耐受摄入量TDI值，而BfR评估分析研究所制定的零容忍极限值似乎并不现实。Birgit Christall博士表示：“真正有意义的是将食品和饲料中的吡咯里西啶生物碱含量保持在尽可能低的水平上，但是，相关的检测样本和有效样本数量，需要以高灵敏度和高效检测分析技术为前提。

测定吡咯里西啶生物碱

图2 测定吡咯里西啶生物碱时使用的是一套“组合检测仪”：自动化固相萃取SPE采用的一台多用途采样器（Derstel公司的MPS型）与Agilent技术公司研发生产的LC-MS/MS高效液相色谱-质谱微量元素分析系统（1290 HPLC + 6495三重四极杆质谱仪）

　　有效的消费者保护措施

　　包括：饲料和食品在内的农产品吡咯里西啶生物碱检测分析远比BfR风险评估研究所发表的一份主题声明复杂的多。BfR风险评估研究所在该份主题声明中指出：由于吡咯里西啶生物碱具有多种不同的异构形式并在多种不同的食品中出现过，对其进行检测分析是一项非常艰巨且具有挑战性的任务。

　　近年来，BfR风险评估研究所开发出吡咯里西啶生物碱具体的检测分析和试验验证方法。这些方法可以在国家和工业企业食品、饲料生产和监控中使用，然而，目前只有有限的吡咯里西啶生物碱可以作为参考标准使用;意味着：BfR风险评估研究所需要开发更多的检测分析方法，以便能够对所有的吡咯里西啶生物碱类别进行检测分析。

　　BfR风险评估研究所推荐的吡咯里西啶生物碱检测分析方法是：首先，需要用固相萃取技术SPE对植物材料中的吡咯里西啶生物碱进行富集，然后，用高效液相色谱-质谱(LC-MS/MS)微量元素分析法进行检测分析并在硫酸水的超声波浴池中对植物材料进行两次吡咯里西啶生物碱萃取并用离心机对萃取到的样本液进行离心分离、等分上清液并加入C-18试剂进行固相萃取。在利用甲醇洗脱吡咯里西啶生物碱后，将洗脱液全部蒸发掉，将剩余残留物溶解于甲醇-水混合液(HPLC高效液相色谱法初始条件)中，接下来，进行色谱分离与质谱检测。

　　专门从事食品和饲料检测分析的专业实验室领导人、食品技术专家Franziska Chmelka女士表示：“BfR风险分析研究所推荐方法的最大缺点是：工作量大、检测分析时间长，尤其是：样本制备时间过长。”为了提高检测分析的效率，她领导Tela实验室对BfR方法进行了自动化控制。

　　所使用的检测分析技术

　　Franziska Chmelka女士及其同事们运用的是一套“组合式检测仪”：自动化固相萃取SPE运用多用途采样器(Derstel公司的MPS型)、Agilent技术公司研发生产的高效液相色谱-质谱(LC-MS/MS)、微量元素分析系统(1290 HPLC+6495三重四极杆质谱仪)。

　　检测分析样本分离是在标准的反相高效液相色谱状态下进行(Nucleodur公司，C18，HTec：250×2 mm×5 μm，MN色谱柱)，运用5mM甲酸(洗脱液A)和甲醇(洗脱液B)时的洗脱梯度为：0分钟(5%B)-3分钟(5%B)-7分钟(20%B)-13分钟(20%B)-16分钟(65%B)-17分钟(95%B)-20.1分钟(5%B);流速为0.25 mL/min，色谱柱柱温为28摄氏度，注入洗脱液为5 μL;利用(MRM多反应监测设备，ESI positive型)的多反应监测模式对分析物进行检测分析。

　　在方法开发过程中，使用的是BfR方法中提供的17种不同吡咯里西啶生物碱标准水溶液：单猪屎豆碱、芝麻菜叶千里光碱、中间素、豚草、石松胺、野百合碱的N-氧化物、芝麻菜叶千里光碱N-氧化物，中间素N-氧化物，光萼野百合碱，豚草-N-氧化物，春生千里光碱，千里光碱，光萼野百合碱N-氧化物，春生千里光碱N-氧化物，千里光碱N-氧化物，毛果天芥菜碱和毛果天芥菜碱的N-氧化物。