多肽纯化十问十答

　　一条多肽产品中除了多肽本身还包括生产过程中带入的水份及有机盐分等杂质，多肽纯度仅指多肽本身所含肽产品的含量及杂质的含量，不包括水份等杂质;而多肽含量则是指目标多肽在产品中的净含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法来检测;因此一条多肽即使纯度达到99%，因为产品中还包含水份及有机盐分等，它的含量可能也只有70-80%。

　　2 如何溶解多肽?多肽样品在上制备柱前为什么需要进行前处理?有哪些前处理的方法?

　　多数多肽都可以用超纯水溶解，对于一些难溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，对于酸性多肽，可先以小量碱性(如0.1%氨水)溶液溶解，然后稀释至所需浓度，对于碱性多肽，可先以小量酸性(如醋酸，三氟乙酸)溶液溶解，然后稀释至所需浓度，对于疏水性多肽，可用强极性有机溶剂溶解，如DMF，甲醇，丙醇，异丙醇，DMSO等。制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，因此有必要对样品进行前处理以有效延长制备柱的寿命。主要方法有5种：萃取、过滤、离心、上预柱、加在线过滤器。

　　3. 为什么流动相中要加入三氟乙酸作为离子对试剂，还有哪些流动相体系或离子对试剂可用于多肽的分离纯化?

　　目前常用的流动相体系是水加乙腈，以三氟乙酸(TFA)为离子对试剂，根据不同多肽以合适的梯度洗脱分离多肽。加入三氟乙酸能调节洗脱液的PH，同时作为离子对试剂与多肽相互作用，从而增强分离效果，明显改善峰形。其它可用于多肽分离纯化的流动相体系或离子对试剂包括醋酸体系，磷酸体系，盐酸体系，七氟丁酸等通过适当的调节PH都能取得很好的分离效果。

　　4. 如何选择纯化过程中使用的色谱柱填料?

　　不同序列的多肽理化性质及疏水性有很大的区别，多数情况分子量小于4000和亲水性多肽用C18柱分离效果最佳，分子量大于5000和极端疏水性的多肽以C4柱分离效果最佳，而C8柱介于C18和C4柱之间，其应用效果与C18柱更相似;对一些特殊选择性的多肽，也可选择苯基柱和聚合物色谱柱。

　　5. 在纯化过程中选择聚合物填料的原则是什么?

　　需要使用高于正常pH或温度条件进行纯化时，可以使用pH范围极宽的聚合物色谱柱，它的优点就是在极端pH条件下不会降解，可以使用强酸和强碱作为流动相进行分离纯化。

　　6. 影响多肽纯度检测结果的因素

　　影响多肽纯度检测结果的因素很多，主要包括：流动相体系、色谱柱型号、柱温、波长及色谱仪的性能指标，每一项不同都可能造成结果产生误差。

　　7. 在多肽检测过程中经常出现基线漂移的原因是什么?怎么解决?

　　固定三氟乙酸浓度的梯度洗脱有时会在210-220nm检测处造成吸收基线的漂移，这是许多反相分离中基线漂移的原因。降低或消除由于三氟乙酸光谱吸收变化引起的基线漂移需要尽量使检测波长靠近215nm，并在溶剂B中比在溶剂A中少加15%的三氟乙酸补偿基线漂移。例如溶剂A中的三氟乙酸为0.1%时，溶剂B中可用0.085%。

　　8. 反相色谱分离纯化后，怎样去除产品中流动相产品中的TFA，乙腈等杂质?

　　冻干的办法应该可以除去大多数TFA和乙腈，只要不超过允许范围，这种办法是最简单、有效的。对TFA含量要求更高的一些药物肽冻干的方法一般无法完全达到要求，需要进行专门的转盐或脱盐。

　　9. 多肽一般有哪几种盐的形式?通过什么方式转盐或脱盐?

　　多数多肽都是在TFA体系下分离纯化的，所以多肽以TFA盐的形式最多，其次药物肽一般有醋酸盐及盐酸盐的形式，极少数药物肽会有一些特殊的盐形式。转盐方式多为离子交换法和HPLC法，而脱盐可用透析袋和超滤膜。

　　10. TFA在缓冲液中是不是只起到调节PH的作用?TFA的浓度越高基线漂移越厉害，那是不是说TFA的浓度在缓冲液PH允许的情况下越低越好?

　　(1)TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。

　　(2)同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。

　　(3)走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。