高效液相色谱法测定开光复明丸中黄芩苷的含量

开光复明丸为《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂)第3册收载品种[1]，是由栀子、黄芩等18味中药组成的复方制剂，具有清热散风，退翳明目等作用。用于肝肺热盛引起爆发火眼，红肿痛痒，眼睑赤烂，云翳气蒙，羞明多眵。黄芩的有效成分为黄芩苷、黄芩苷元、二氢黄酮等黄酮类化合物，现代药理试验证明，黄芩苷有抗微生物、抗变态反应和抗炎等显著作用，因此选取黄芩苷作为质量控制的指标成分。正文采用高效液相色谱法测定样品所含黄芩苷的含量，该法灵敏度高、专属性好、操作简便、重现性好，测定结果准确、可靠，可作为本品质量控制的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪;VWD紫外检测器;AX205梅特勒-托利多电子分析天平;KQ-300VDB超声波清洗器。

1.2 试药 甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸(分析纯)(为北京化工厂生产)。黄芩苷对照品(批号110715-200514，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供)。开光复明丸三批(批号6013864;6013865;6013866)，中国北京同仁堂(集团)有限责任公司北京中药二厂。

2 实验方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取黄芩苷对照品10.06mg，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀;精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含黄芩苷0.04024mg)。

2.1.2 供试品溶液 取重量差异项下的本品，剪碎，取约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加入70%乙醇适量，密塞，超声处理(功率300W，频率 40kHz)30min，放冷至室温，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2ml，置10ml量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方比例，取不含黄芩成分的阴性制剂，同供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件[2] 色谱柱：ZORBAX SB-C18 (250mm×4.6mm，5μm)分析柱;流动相：甲醇-水-磷酸(50：50：0.2);检测波长：277nm;流速1.0ml/min;柱温：40℃。分别取黄芩苷对照品溶液、供试品溶液(批号：6013864)、阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测得的分离色谱图如图 1显示。结果表明，黄芩苷与其他成分分离良好，不干扰测定，测得理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于2500，黄芩苷峰与相邻峰的分离度大于1.5，符合要求。

1.黄芩苷

图1 HPLC色谱图2.3 线性关系 精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解并制成每1ml含0.2012mg溶液，作为储备液。分别精密量取对照品储备溶液0.5、1.0、2.0、3.0、 4.0ml置于10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按正文所述色谱条件测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归处理。得黄芩苷回归方程：Y=29.59708249X-69.11618323, r=0.9991 ,n=6，表明黄芩苷在0.1005~0.8048μg范围内有良好的线性关系。

2.4 回收率试验 称取已知含量的同一批样品(批号6013864，含量为3.927mg/g)约0.3g(6份)，精密称定，分别精密加入黄芩苷对照品溶液 (0.04312mg/ml)各25ml，按供试品溶液制备及上述色谱条件操作，依法制备、进样、记录色谱图、计算回收率，结果见表1。表1 开光复明丸中黄芩苷加样回收测定结果

2.5 稳定性试验 精密称取供试品(批号6013864)0.5060g ，照正文所述方法制备供试品溶液，照上述色谱条件，分别在0、1、4、9、20、24h依法测定，记录峰面积，结果峰面积的RSD%=1.2% (n=6)。表明在24h内基本稳定，本方法有良好的稳定性。

2.6 精密度试验 取供试品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，峰面积的RSD%=2.59%(n=6)。

2.7 供试品含量测定 精密吸取黄芩苷对照品溶液和供试品溶液各10μl，按上述色谱条件测定，以外标法计算样品中黄芩苷的含量，共测定3批供试品。结果见表2。表2 供试品含量测定结果

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 在本试验中称取同一批号的样品，分别加入30%乙醇、50%的乙醇、70%乙醇及甲醇等溶剂，进行超声处理30min，按照正文含量测定项下方法进行测定，结果表明，采用70%乙醇为溶剂，提取较完全且分离良好，峰形良好。

3.2 提取方法的选择 在本试验中称取同一批号的样品，采用70%乙醇考察了回流提取、超声提取、冷浸提取等方法，结果表明，超声处理30min相当于1g样品的峰面积最大，因此采用较为简便的超声处理提取方法。

3.3 流动相的选择[2] 参考文献《中国药典》2005年一部黄芩项下含量测定方法所用的流动相，分别采用甲醇-水-磷酸(50：50：0.2;47：53：0.2;53：47：0.2)为流动相，进行实验，结果表明以甲醇-水-磷酸(50：50：0.2)为流动相时，黄芩苷基线分离，且峰形较好，故选择流动相为甲醇-水-磷酸 (50：50：0.2)。

3.4 最大吸收波长的选择 黄芩苷对照品甲醇溶液(浓度为0.03048mg/ml)经紫外吸收光谱扫描，在277nm处有最大吸收，故确定检测波长为277nm。

3.5 方法适用性 本法色谱条件与系统，能较好地将开光复明丸中黄芩苷与其他成分完全分离，说明本法能准确地测定开光复明丸中黄芩苷含量，结果稳定、重现性好。为开光复明丸制剂的质量控制提供了可靠的依据。

【参考文献】

1 国家药典委员会.中国卫生部药品标准中药成方制剂.北京：卫生部药典委员会，1998，33.

2 国家药典委员会.中国药典，一部.北京：化学工业出版社，2005,211-212.

3 杨娟,黄敬群,李红. HPLC法测定乳结消片中橙皮苷和黄芩苷的含量. 沈阳药科大学学报,2008,25(9)：732-735.

4 范强,孙毅坤,史新元,等. 高效液相色谱法测定国公酒中3种成分的含量. 药物分析杂志,2007,(7)：958-960

来源：实验与分析