物质转化过程的分析和监测

在酶和微生物反应过程中起始物质借助于生物催化剂例如酶、微生物、植物和动物细胞的作用被转化为具确定化学组成的物质，反应在10~40℃，pH5~9的范围内进行。起始物被转化成具有地域选择性或对映选择性的物质，那些活化了的目标分子仍保持着它们的结构。为了检测和评价物质的转化，需要一种能够按照特定条件进行计算的分析技术。GC和HPLC可满足这种要求，且已在生物分析实践中得到成功运用，采用手性分离柱就可将生物反应产物与起始物分开。

当前技术的弱点

迄今可供使用的微滴板和摇动装置在反应和分析单元中一直是互相分开使用的，虽然在采用常规的光学测量方法时情况并非如此，可是它所提供的信息内容却远远不及采用现代GC和HPLC系统产生的信息。根据一项研究和发展计划，由柏林的Bioworx公司与色谱专家Gerstel以及富有经验的用户进行合作，共同开发了这种Gerstel-MPS-生物扫描系统，只需进行少量实验便能获得关于各种生物化学过程的大量信息，并能快速得到转化的结果，全部过程自动化。

实验的建立

反应体系应具有灭菌和可密封的容器，该系统的容积应能允许一台自动进样器工作、允许进行有效的手动操作以及高的样品流通量。按照匀质性和嗜氧性微生物的生长要求，样品应混合均匀，而且允许以既隔绝空气又可通气的方式进行密封。研究表明，GC 可以对正在进行的生物过程的反应动力学方便地实施监控和分析，而且是在GC的顶空小瓶中进行。通过对顶空小瓶瓶盖的改进，确立了嗜氧性和厌氧性进行的生物过程，并用1~15ml体积实现了反应的重现性。为使这类色谱分析和监测自动进行，需要使用机动灵活的自动进样器。这里采用的是Gerstel多用性进样器（MPS），一种适用于气相和液相色谱实验室用的可自由编程的XYZ三维机器手。

为完成生物技术和生物分析方面的任务，这种MPS进样器特装配了一种低电感运行的磁搅拌器，用这种磁搅拌器可将顶空小瓶控温于10~120℃范围之内。

样品前处理方法的改进

样品的前处理可以根据个性化的要求通过选择理想的混合方式和混合速度加以显著改进。其中之一是对样品不用摇动而用搅拌的方法进行制备。按照专家意见这样做可以保护SPME-纤维。搅拌器007装备有6个样品瓶位，另一扩展装置则采用32个样品位进行工作。顶空小瓶适用于微生物和细胞培养。采用一种带螺纹的不锈钢瓶帽对小瓶的密封进行了必要的改进。对于厌气性研究研发了一种膜密封，而对于嗜氧性研究和嗜氧性细胞培养研发了透气性密封盖（多孔硅）。实验用的小瓶可以带介质和不带介质的方式在蒸汽灭菌装置中于121℃进行灭菌。

通过与柏林工业专科学校的共同研究，确定了10~20mlSPME和HS-小瓶在何种程度上适用于生物转化系统。对于不同的物质群优化了填充高度和测量方法，并研究了如何将这些生物活性物质的分析传递到生物转化系统上去，所获得的测试结果表明具有良好的重现性。

由于这种SPME-HS分析法较之于普通市售的顶空技术灵敏得多，即使是较低的物质浓度也能顺利检出。由苯乙酮转化为苯乙醇时的测量证明：在苯乙酮产生的信号增强了85倍，而在苯乙醇产生的信号甚至增强了480倍。这是通过加入一种对于醇具选择性的固相微萃物质达到的。因此，实验的关键是如何让SPME-HS测量方法适合于待分析物质的要求。

对不同的生物转化都是采用直接的SPME-HS监测来进行的，借助于校正曲线可以根据所测峰面积计算出相应的转化率。由苯乙酮转化为苯乙醇的两种不同浓度的情况，显示已成功建立气相平衡（图1）。测量时两种实验都是在气室中利用SPME-HS进行的，由此得到平滑和均匀的转化曲线。通过微生物进行转化时加入0.25%苯乙酮的转化率为90%，而加入0.5%苯乙酮的转化率为一半。在诸如2-辛酮时这种SPME-HS监测法也显示出良好的重现性。

为了说明测量过程中SPME-HS吸附动力学的特点，对于标准物质都记录了采用不同SPME-HS材料的饱和曲线。过程表明，固相微萃针在小瓶气室中的培养时间连续地增加，直至所测峰面积不再成比例地增加以至不再增加。从图2可以看出，苯乙酮迅速达到饱和峰面积，而苯乙醇的峰面积即使在15min之久仍然未达稳定值。随着培养时间的增加，气室中苯乙醇的富集平衡向针的方向移动。重要的是需要准确保持顶空固相微萃针的培养时间。为考察SPME测量的重现性，对加有分析混合物质的标准进行了多次测量，并对结果的标准偏差和百分误差进行了计算。图3显示了两种典型的离析物/产物混合物的中值及其偏差。尽管在标准偏差相同的情况下，对于数值较小的测量而言，其（相对）误差会更显著一些，不过由于误差都很小，所以对于扫描体系的应用来说精密度和重现性都是良好的。

图1. SPME-测量法应用于0.25%和0.5%的苯乙酮（AP）的微生物转化。

图2. 分析物质在SPME-纤维上的吸附。

图3. 采用不同离析物/产物时（物质50:标准50）SPME-测量的重现性。

实验中还运用SPME-HS测量体系对所测试的物质建立了校正工作曲线，检测了重现性。采用这种校正曲线可以将扫描实验所测数值换算为物质的转化率（图4），正如计算由苯乙酮向苯乙醇的转化那样。此处显示出测量过程良好的线性和重现性（相关系数0.995）。这一测定是将固相微萃针在气室中的培养时间定为10min时进行的。当然在物质浓度较高时选择较短时间更有意义。采用2min和5min时间时也得到了良好的重现性。

图4. 采用SPME-纤维（聚丙烯酸酯）时苯乙酮和苯乙醇的校正曲线。

比例放大的可能性

为了对一定的物质在不同生物催化剂作用下的转化进行监测和加以改进，我们还在所开发的SPME-HS-GC的反应和分析单元中进行了一系列不同的生物转化实验、分析和评估。按照有可比性的小型实验安排和采用加入物为少量的微生物和测试物质的方式，试验并确定了为数众多的加入物种类。具有手性分离柱的气相色谱可对测量结果进行快速评估。根据对小型化加入物实验和200~2000ml批量化加入物实验的平行性研究，可以直接对不同加入量进行比较。比例放大的重要因素是：一致的温度、具可比性的通风以及可转移的容积/表面积比。实验表明在小型化的体系中可以按照大约1：100的比例进行放大而保持结果的良好重现性（图5）。此外，关于pH值对于微生物活性的影响的研究也很重要。关于温度、通风和离析物浓度也进行了类似的研究。由此产生了两组参数，一组是与系统无关而可以对每种加入物进行调节的参数（例如pH、离析物浓度、糖的浓度和进料），另一组与系统有关和与搅拌体系有关（例如温度以及与搅拌器转速有关的通风）。这些与系统有关的参数对于大多数扫描体系而言是具典型意义的。就温度来说，无论是在微滴板上，还是在加热体中，或者在温度控制单元内，都可能保持温度不被改变（图6）。

图5. 由4-羟基-2-丁酮还原为1,3-丁二醇时数量的比较。

图6.在SPME-HS扫描系统中酵母对苯乙酮还原的研究。

前景展望

通过对物质专门和直接的检测不仅可以描述转化的量，而且还能说明转化的质（物质的证实、对映选择性等）。相对于常规光度检测法来说这是一个优点。采用气相色谱可以很快发展一种检测方法，以简洁的方式解决由起始物转变成产物的问题。根据系列实验所得到的经验已经制定了一套工作指南用于指导如何运用本系统进行扫描和优化实验。这种带有Gerstel-MPS 多用型进样器生物扫描系统的SPME-HS-GC反应和分析单元为有机合成的发展和生物转化的研究提供了可能性。利用这种快速扫描实现了在很短时间内在广谱意义上对生物催化剂进行多达64项平行的分析和评估研究。在这种全自动的装置上可以每天24h开展实验。除了能够开发生物转化信息外，还可研究降解和物质转化过程，并且借助气质GC/MS和液质LC/MS对所生产的降解产物进行跟踪。