三聚氰胺的样品制备及检测

三聚氰胺是一种重要的化工材料，本来与食品、饲料行业毫不相干，但是发生在美国的数起饲料致死宠物的事件使两者联系在一起。经过调查，发现这些进口饲料中含有一定浓度的三聚氰胺，对此，美国食品药品监督管理局（FDA）要求饲料厂商提供三聚氰胺的检测报告，因此，三聚氰胺事件也使得分析领域掀起了检测方法的开发热潮。

三聚氰胺事件变成社会热点话题是在2007年3月份，美国大量召回被三聚氰胺污染的宠物饲料，起因于宠物饲料致死猫狗的事件。据不完全统计，北美地区仅美国因食用有毒饲料而死亡的宠物就有上万只, 相关投诉不计其数，美国食品药品管理局调查显示，在回收的宠物食品、 死亡动物的尿液结晶和肾脏细胞中都发现有三聚氰胺，研究人员还发现, 回收宠物食品所用的小麦谷蛋白添加物中有较高浓度的三聚氰胺存在。尽管国内尚无动物中毒死亡或产生不良反应的报道，对于三聚氰胺的毒性也有些争议，但三聚氰胺不是饲料原料，也不是国家允许使用的饲料添加物。某些不法厂商添加三聚氰胺主要是为了增加产品的表观蛋白质含量，三聚氰胺被广泛添加到淀粉、谷朊粉、蛋白粉中，致使不仅是饲料生产商，其它的食品工厂也需要三聚氰胺的检测以保证他们产品的安全。

三聚氰胺理化性质

三聚氰胺（melamine）简称三胺，学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式：C3N6H6、C3N3（NH2）3，分子量：126.12，是一种重要的氮杂环有机化工原料。物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味，相对密度：1570kg/m3，熔点 ：在常压下，354℃分解，升华温度：300℃。溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳。水溶液呈弱碱性。化学性能：三聚氰胺显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物。三聚氰胺与醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、厨房用具、防火纤维、商业滤膜、胶水和阻燃剂，在部分亚洲国家，也被用来制造化肥。

样品前处理方法

固相萃取（SPE）柱的选择

三聚氰胺呈弱碱性（弱阳离子化合物），净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱（PCX）通过将磺酸基团（-SO3H）键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：

可通过两种不同溶液的洗涤（水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂），使样品更干净，提高检测的灵敏度；

批次重复性好；

回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。

综上考虑，检测中选择混合型的阳离子交换柱（Agela ClearnertTM PCX）来净化样品。

样品前处理步骤

标准样品配制

取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50ml得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提取液（0.1%三氯乙酸）稀释至所要的浓度。

提取

称取饲料样品5g，加入50ml 0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2ml 2%乙酸铅溶液，超声20min。然后取部分溶液转移至10ml离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3ml过混合型阳离子交换小柱（PCX）。

净化（PCX小柱，60mg/3ml）

活化及平衡：3ml甲醇，3ml水；上样：加入提取液3ml；淋洗：3ml水，3ml 甲醇，弃去淋洗液并将小柱抽干；洗脱：5ml 5%氨化甲醇（v/v）洗脱。（5%氨化甲醇的配制：5ml氨水+95ml甲醇）；浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2ml，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。

HPLC检测方法

三聚氰胺HPLC-UV检测方法

三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔（Agela） ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果，分析色谱图见图1。

由表1可以看出：用PCX柱净化样品，可以得到满意的回收率，此方法处理样品，比FDA公布的前处理方法更加准确、可靠。

三聚氰胺LC-MS检测方法

由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了液质联用方法的使用；但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，不能得到较好的分离定量。

基于此问题，艾杰尔科技公司自主开发了新的方法，采用艾杰尔（Agela） ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离。因此方法中流动相不含离子对试剂，可以用于质谱检测。

与FDA 2007年4月公布的《Updated FCC Developmental Melamine Quantitation （HPLC-UV）》相比较，该方法大大降低了最低检测限（MSD 0.5ppm UV 2ppm），提高了检测灵敏度。以该方法得到的谱图见图2。

LC-MS方法小结

该方法具有以下优点，检测过程简便：无须添加离子对试剂，三聚氰胺就可得到良好的保留与分离，避免了配制离子对流动相的复杂过程；提高了检测的灵敏度：无离子对试剂，可以用于质谱检测器，大大降低了最低检测限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm）；降低了检测成本：不用离子对试剂，就不再需要买价格较贵的离子对试剂了，从而降低了检测成本；延长了色谱柱的使用寿命：避免了使用离子对试剂减少色谱柱寿命的影响；该方法所使用的色谱柱具有通用性：无论是用FDA方法、中国农业部部颁标准方法和本公司开发的LC-MS方法，使用艾杰尔（Agela） ASB系列亲水色谱柱均能得到一个很好的检测结果，从而给客户提供了多种选择空间。

来源：实验与分析