同时测定三聚氰胺和三聚氰酸

由于宠物食品被三聚氰胺和三聚氰酸污染，当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在时会形成一种不溶结晶物，这种物质可能影响到肾脏功能，最近的研究发现很多宠物的死亡和健康问题是由此引起的，受污染的麦子、稻米和玉米可能被制成人类食物如面包、意面、婴儿食品等，所以对原材料包括可疑性动物组织中三聚氰胺和三聚氰酸的检测就十分重要。

现在对三聚氰胺和三聚氰酸的定量方法包括气质（GC-MS）和液质（LC-MS）。GC-MS的缺点是需要费时费力衍生化，而报道的LC-MS方法需要很长时间的梯度运行及柱子清洗。

本文介绍了一种灵敏、简单和高通量的LC-MS方法，使用稳定的同位素标记的内标物（ISTD）来定量，可同时测定三聚氰胺和三聚氰酸。

使用戴安公司最新开发的混合基质柱WAX-1来分离被分析物，此柱子利用疏水和离子交换混合作用机理来达到特殊的选择性和保留。色谱运行时间仅用8min，MSQ质谱检测器确保选择性和灵敏度。对于两种物质（2~200 ng/ml）的线性都能达到R2>0.9995。方法检出限（MDL）方面，三聚氰胺为3.97 ng/ml，三聚氰酸为3.32 ng/ml。

本文通过宠物食品提取物以及生物基质（猪肉和鱼肉组织的提取物）来验证方法的可靠性，宠物食品用快速、简单和自动的提取方法处理。生物样品来自美国FDA，并按规定方法处理。

实验条件

仪器及软件

戴安Summit HPLC系统：P680 泵；ASI-100 自动进样器；TCC-100 柱温箱；UVD-340 UV-Vis 检测器；戴安MSQ Plus单四极质谱检测器（ESI源）；Chromeleon 6.8色谱管理软件。

分析柱：戴安公司Acclaim 混合基质柱WAX-1（150×2.1mm, 5um）；流速：等度90%乙腈/10% 20mM pH4 醋酸铵缓冲液（v/v），0.25 ml/min；柱温：20℃；进样量：5ul。

MSQ质谱条件

分析模式：SIM带极性切换；锥孔电压：50 V；间隔时间：0.5 S，对于所有SIM通道；探针温度：500℃；扫描：4 SIM全程扫描，两个不同极性的全扫描（100~400 m/z,250 ms），见表1。三聚氰胺和三聚氰酸的结构以及全波段扫描的质谱图见图1。

图1. 全波段扫描三聚氰胺和三聚氰酸的质谱图。

1. 全程扫描

色谱条件

色谱方法开发

色谱优化

流动相组成：在HILIC模式下，高有机物浓度的流动相容易使极性物质保留更长，并在ESI条件的MS上有更大的响应。然而，在WAX-1柱上的分离由于有弱阳离子的交换，对流动相中离子强度和pH的改变很敏感。为了保持方法的重现性，需要合适的缓冲容量，所以选择10% pH4的醋酸铵。

缓冲液pH

当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在于不同pH条件的不同基质（有机、离子或混合物）中，越是在疏水的环境下保留时间越长，这可以用离子交换机理来解释。pH对保留时间的影响效果见图2。

图2. 流动相pH值对保留时间的影响。

离子强度

戴安的WAX-1混合基质柱由于弱阳离子交换模式能为极性物质提供特殊的选择性，极性越大的化合物对流动相离子强度的依赖越大。如图3所示，通过将流动相的总离子强度从2.75mM增加到11.0mM，三聚氰酸的保留时间可以从12.42min减少到7.40min。

通过几个色谱因子的综合考虑可以为方法优化提供更大的适应性，并能控制三聚氰酸的保留时间，大概在6~15min的范围。

图3. 流动相的总离子强度对保留时间的影响。

质谱检测优化

质谱检测的优化和色谱的优化相结合。图4是最优化分离度、灵敏度和高通量方法的校准标准色谱图。

图4. 最优化条件下的校准标准色谱图。

宠物食品的方法验证

线性和校正曲线

美国FDA的校正标准中，使用稳定的元素标记物（三聚氰胺－15N3和三聚氰酸－13C3）作为内标物（ITSD）。这些标准物用来做标准曲线，计算线性。从2ng/ml到200ng/ml的范围内的线性非常好，可见图5，图6。

图5. 三聚氰胺的校准曲线。

图6. 三聚氰酸的校准曲线。

方法检测限（MDL）

方法检测限通过对校正标准物7次重复进样，以及下面方程式来计算：

MDL=tgg%×S｛n=7｝

t在99%的置信区间（tgg%，n=7 = 3.143），S为标准偏差。三聚氰胺和三聚氰酸的MDL分别为3.97 ng/ml和3.92 ng/ml。

生物样品的方法验证

色谱图

从美国FDA获得的猪和鱼组织提取物（控制和加标样）用FDA的标准来处理，所有的生物样品挥发干后用流动相重溶。图7是控制样品（空白猪肉样品的提取物，提取前ISTD，三聚氰胺或三聚氰酸加标）的SIM色谱图。

图7. 对FDA控制样品挥发并用流动相重溶后测定的色谱图。

重现性

由于多次进样会对色谱造成影响，未知化合物的积累造成干扰，这些干扰物需要额外计算，例如梯度运行或柱子清洗，因此验证方法的重现性是非常重要的。在这个研究中，通过重复进样三聚氰胺和三聚氰酸加标样品来验证方法重现性，结果见表2。对三聚氰胺的保留时间和量的重现性都非常好。三聚氰酸保留时间的重现性有一点变换，可能是样品处理中残留的甲酸的影响。

表2. 方法重现性

结论

本文介绍了一种简单、快速的LC-MS方法，可同时检测三聚氰胺和三聚氰酸，三聚氰胺和三聚氰酸的保留时间和整个分析周期都令人满意，方法重现性也得到验证；质谱检测器的检出限<5 ng/ml；线性极佳，在2~200 ng/ml的范围内R2>0.9995。目前该方法已用于分析美国FDA处理的生物样品。