全基因测序法分析STEC

德国STEC疫情发生后，全球多个研究团队都在借助快速全基因组测序来分析疫情的爆发，诠释其序列信息，并开发能够从食物样本中检测到此菌株的特异性试剂。Life Technologies公司协助开发一种解决方案——从阐明最初序列信息到开发分离菌特异性检测试剂的完整工作流程。在与多位临床医生和多家公共卫生中心的合作过程中，科研人员提供了互补性技术，并应用生物信息学知识加速了检测试剂的开发。

初步序列鉴定

德国国立溶血性尿毒综合症咨询实验室的科研人员应用经典的血清学分型方法和基于Sanger测序法的毛细管电泳测序技术（CE），对该疫情致病因子的特征进行研究，并使用Applied Biosystem 3130基因分析仪进行多位点序列分型（MLST）研究。基于多条基因的序列片段，MLST技术能够对分离菌进行鉴定。针对此次疫情的目标分离菌，选取的序列片段长度大约为450~500bp，覆盖了每条基因，并以这些基因座上发现的等位基因定义了其特征和序列类型。通过比对此前鉴定的菌株的数据库，得到假设性的鉴定结果。此次爆发的O104:H4菌株属于ST678，与2001年分离到的2型志贺毒素（Stx2）阳性的O104:H4菌株（HUSEC41）属于同一类型。

随后，通过CE测序得到了800bp的Stx2基因，藉此鉴定了其等位基因特征。通过这些初步信息，此序列被鉴定为大肠杆菌O104:H4，含有stx2和iha基因，但不含eae基因，能合成超广谱β内酰胺酶（ESBL），对庆大霉素和氟喹诺酮敏感。

快速基因组测序

尽管完成了对菌株的初步鉴定，但要开发菌株特异性检测试剂还有赖于全基因组测序。这种检测试剂能够快速检测出受大肠杆菌O104:H4污染的食物，还能协助寻找传染的源头，对公共卫生策略和减少外交纠纷至关重要。

随着新一代测序技术的到来，研究人员将能够在短时间内获得大量的序列信息。在使用Ion Torrent个人化操作基因组测序仪（PGM）进行测序之前，DNA序列首先被片段化，每条DNA片段都将在一个微粒上得到扩增（即克隆扩增）。在公共卫生重大疫情爆发中，样本制备过程的简化是至关重要的，而PGM测序工作流程正是如此。事实上，PGM能够帮助研究人员在2h内得到高质量的基因组序列信息。另外，Ion 314芯片上的每个运行反应都能产生至少10Mb的高质量序列信息。整合上一步样本制备过程，此测序技术能够于一天之内提供完整的从DNA样本制备到序列信息获得的研究工作流程。

Ion PGM测序仪工作流程

通过声波降解法，将纯化后的细菌DNA进行片段化，得到各种约150bp的DNA片段。其他用于DNA片段化的方法（如机械剪切和酶剪切），也能通过随机剪切得到类似长度大小的片段。依据标准化的Ion片段文库制备试剂操作流程，分别使用1μg?DNA，构建了该细菌的两个文库：一个文库的片段平均长度为187bp；另一个的片段平均长度为211bp（包括接头序列）。DNA片段被连接上Ion专用接头序列，并在颗粒上得以扩增，进而使每个颗粒都拥有数千倍的单一片段克隆产物。随后这些颗粒被载入到Ion 314TM芯片中，进行半导体测序，产生大约100bp的读序（图1）。使用两套Ion PGM系统，可在2天之内运行10张314芯片。

所得读序可通过重组装或从头组装的方法进行拼接，这些读序还可映射到菌株EDL933（包括质粒）基因组上，以评估通量。一旦完成测序即可组装（Box1），得到了表1中的详细结果。大肠杆菌O104:H4菌株LB226692基因组序列已经提交到NCBI中。该技术的真正威力是能够在几天之内获得初步序列信息，这些序列信息有助于科研人员快速精准确定有毒菌株的特征。

德国明斯特大学附属医院卫生研究所科学家Alexander Mellmann博士评论：“快速全基因组测序结果让我们在数天之内就发现了独一无二的毒性特征组合，并获知引起此次德国疫情爆发的大肠杆菌克隆类型是由不同大肠杆菌致病变种杂交而成的。”

分离菌特异性检测试剂

国立溶血性尿毒综合症咨询实验室开发了一种基于凝胶电泳的终点法定量PCR检测试剂（其中包含4对引物分别用于检测4条基因，即stx2、terD、O104rfb和fliC H4）。通过分析PCR产物的大小，就可验证这4条基因是否存在。

为了加快检测过程和提高检测通量，科研人员开发了一种实时荧光定量PCR检测试剂，用于食品样本中大肠杆菌O104:H4菌株的检测（Box2）。这种基于TaqMan探针技术的检测试剂堪称食品污染检测的绝佳选择，因为它具备引物结合的高特异性和TaqMan探针结合及水解的高特异性（图2）。该试剂将能够精准地检测到食品中的毒性菌株，且不用担心因相似菌株引起的假阳性干扰。此外，TaqMan检测方法还具备高灵敏度和宽线性范围（图3）。基于这新获得的参照序列，科研人员加快设计开发的进程， TaqMan检测试剂仅在1周之内就得以广泛应用。

小结

应用快速全基因组测序方法和实时荧光定量PCR检测试剂，可在2周内完成从临床致病菌的离菌到特异性检测试剂开发的整个过程，应用CE测序技术可进行最初的靶向检测。Ion PGM测序仪的快速性和简便性可在两个不同地理区域内完成全基因组测序。Applied Biosystems 7500 Fast实时荧光PCR系统的速度和可靠性，及定制化TaqMan试剂的开发速度和高特异性能有效地监控大肠杆菌O104:H4疫情。