快速检测炭疽杆菌--炭疽杆菌的拉曼光谱快速检测法

自2001年美国发生炭疽恐怖袭击事件以来，生化武器对人类的威胁便成为公众关注的焦点。此后，在全球范围内（特别是美国和欧洲）相继发生了多起针对政府、管理当局、大使馆以及个人的伪装式攻击事件。仅在2001年10~11月间，美国就有120000个疑似炭疽孢子的样品被检查，其中多半是夹带不明粉状物的信件或包裹，且附有威胁性提示，令收件人怀疑含炭疽孢子。即便“炭疽孢子袭击”事件已过去11年之久，今天仍存在仿效的行为：如2012年3月，在德国联邦总统选举之前，候选人就收到数十封夹带着不明粉状物质的威胁信件。虽然最终证明只是一些无害的沙粒，但此类“袭击”的后果则是深远和严重的：为了验证其是否含有炭疽孢子，必须在高度安全的条件下于研究实验室中进行鉴定，同时，还要对可能受到污染的实验室和大楼严加隔离，从而带来巨大的人力、财力损失，也令民众陷入不安和恐惧。

图1. 在“炭疽事件”过去11年后，匿名信件中的白色粉末仍让人们心有余悸。

因此，实验室诊断的目标是竭尽技术上的最大可能，尽快对炭疽孢子进行可靠的鉴定。一方面必须查明是否存在炭疽孢子；另一方面还须区别它们是致病性炭疽孢子、炭疽杆菌或是非致病性病菌。此外，还有一些微生物是这种炭疽杆菌的近亲，但于人类却也并非致病性的。2009年8月，悉尼一封威胁信被邮局分检处截留，经查明，信内所含物质为苏云金芽胞杆菌（一种广泛使用的生物灭虫剂）。

目前已有许多成熟的研究方法可用于炭疽杆菌的鉴定分析，如经典的培养法、基因验证法（PCR检测和实时PCR检测）以及免疫技术。然而这些方法都只能在特殊的实验室中进行，而且非常费时，尤其是从环境样品中将细菌分离出来时远比从医院材料的分离要困难得多。

基于上述原因，科研人员特别研发和应用了一种方法，针对被怀疑含有炭疽杆菌内生孢子的粉状样品，可在现场按照预检测的方式于数小时之内进行诊断处理，然后在实验室中采用已建立的方法予以验证。

拉曼微光谱法

该方法测量的原理基于拉曼微光谱法，系一种能够分析1μm数量级微粒的方法。方法以生物微粒探测仪作为测量平台（见图3）。无论是面包发酵粉、沙子、粉状洗涤剂还是有机物孢子，均只生成特有的拉曼光谱线，仿佛专属的光谱指纹。将该物质或细菌的参考光谱线存储于拉曼光谱数据库中，便能对其进行鉴定。1μm的空间分辨率意味着，只需出现少数细菌时便能在理想的情况下对样品做出鉴定意见。由此可省去常规方法中费时的样品处理步骤。由于操作简单而且又能对大多数工作步骤实现自动化，十分有利于现场应用。

面包粉中的内生孢子

下文以添加了炭疽杆菌的面包粉样品为例，探索其检测工作流程。首先用甲醛溶液（约20%最终浓度）对100mg的可疑粉末样品进行1h的处理，使样品中的致病性病原体成为非活性，否则其后的全部工作都必须采取高度的生物防护措施。

将存在的内生孢子从样品中提取出来。此时可应用密度梯度离心法，其机理在于利用内生孢子和样品基体组成（面包粉）之间的悬浮密度差，借以分离孢子与样品残余。最后得到非活性化的内生孢子的悬浮液水溶液，借助拉曼光谱进行分析。分取若干微升的悬浮液，置于测量基质之上，予以干燥，再对其进行分析（如图4所示）。由于测量仪器本质上是与拉曼光谱仪相结合的显微镜，因此能以光学显微镜的方法筛选样品中合适的微粒。这一过程可按照相应的形态标准（如粒度大小或形状）自动进行。将这些微粒逐个引入，并通过波长为532nm的激光按照预定的时间间隔进行照射。将所瞄准的该粒子定为样品，对由其产生的拉曼散射光线予以检测和谱线分解，作为拉曼光谱给出。这种拉曼散射光是通过激光光线与物料之间的交互作用而产生的，不同的物质具有不同的拉曼光谱。此外，该法具有足够的选择性，可以将具有不同生物化学组成的同一种类细菌加以区分。在图4a的视区中测定了4种粒子：两个内生孢子（i，ii）、自由淀粉（iv）和磷酸二氢钠（iii），后两者皆为典型的面包发酵粉组成。内生孢子的拉曼光谱具有专属的钙二皮考啉酸盐的主导谱线带，图4c中以星号标出。最终从多个视区中共收录了100条内生孢子的拉曼光谱并加以量化求值，对基体部分的光谱则事先予以过滤消除。由于不同细菌种类的内生孢子的拉曼光谱无法用肉眼加以辨别，需采用线性判别分析法（LDA）进行鉴定。在准备阶段，科研人员共摄录了5500多条由5种不同杆菌种类（炭疽杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌）与7种家用粉（面包粉、石膏粉、牛奶粉、小苏打粉、止痛药片、沙子和洗衣粉）分离后所生成的单个内生孢子的拉曼光谱，收集于数据库中，并且借助于线性判别分析法进行演练，以便对这5种杆菌加以区分。

在三维空间里，借助于线性判别分析法将数据库的光谱排列为散点图形（见图5a）。每一个椭圆体包含了某种杆菌种类95%的光谱线。两个椭圆体相距越远，表明该两种光谱分隔得越开。将这种算法规则应用于实际待测样品的测得光谱时，光谱就投影成为图5a中的图像。此处清晰可见（图5b中的黑色球状体），光谱线多次出现于通过数据库的该杆菌种类的光谱线所展开的椭圆体中。最终，100条炭疽杆菌的内生孢子中的97个由此成功鉴定完毕。这种方法不仅可用于细菌内生孢子的诊断，还适应于许多其他领域，借以针对微生物代谢的有毒性孢子或致病原进行鉴定。

关于炭疽杆菌

炭疽杆菌是全球范围广泛传播的炭疽病的病原体。其自然源头是具有明显优先于动物饲养区域的土地。这种传染病对于几乎所有的热血动物皆具有极强的传染性，因此属于最具杀伤力的生化武器之一。其植物形态呈现为杆状细菌（见图2a），而在一定的环境条件下（如空气）或者缺乏养料的情况下则转化为内生孢子（见图2b）。借此得以保存其传染性而在土壤中存活数十载，并对大多数杀毒剂表现出很高的抵抗力。拉曼微光谱法是用于快速分析被怀疑含有炭疽杆菌的粉末状样品的新方法。