高效鉴定人参中的有效成分

如何在高分辨数据中，快速发现和鉴定目标结构的化合物，已成为中药成份研究的限速挑战。近年来，LC/MS凭借其高通量、高灵敏度以及强大的定性、定量能力等特点，逐渐成为中药分析的主流仪器。不同类型的LC/MS具有特定的工作流程，AB SCIEX TripleTOF高分辨质谱仪是具有高分辨定性能力和三重四极杆定量能力的新一代高分辨串联质谱仪。运用特有的动态背景扣除（DBS）、质量亏损（MDF）、中性丢失（NL）数据采集功能，一次进样可同时获得高质量的TOF MS和TOF MS/MS，从而完成化学成分的分析和确证。结合PeakView软件中简单快捷的XIC Manager进行目标化合物的筛查和确证，能够提高数据分析速度和数据结果的准确度，成为中药成分分析和鉴定方面得心应手的工具。

图1. AB SCIEX TripleTOF 5600高分辨质谱仪。

实验内容

仪器和试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯，其他有机试剂为分析醇；人参50%甲醇提取液，经SPE处理后获得人参提取液；AB SCIEX TripleTOF 5600质谱系统，岛津公司LC-20A液相色谱。

图2. TripleTOF成分分析工作流程。

采集方法与实验条件

质谱采集方法

TripleTOF 5600，TOF MS-IDA-MS/MS；负离子测定；TOF MS，m/z 100~1600，200ms；TOF MS/MS-10?MS/MS，m/z 50~1300，80ms，IDA；动态背景扣除（DBS）开启。

质谱参数

喷雾电压（IS）： -4500V；去簇电压（DP）：-70V；辅助加热气温度（TEM）：500℃；雾化气（Gas1）：50psi；辅助加热气（Gas 2）：50psi；气帘气（Curtain gas）：30psi。

液相条件

流速：0.2ml/min；流动相：A相：0.02%甲酸水溶液；B相：0.02%甲酸乙腈溶液。色谱柱：Phenomenex Luna 5μm, 2.1×150mm)，梯度洗脱。

图3. 人参皂苷结构特点。

数据处理工作流程

通过智能DBS-IDA采集方法，一次进行获得高分辨的TOF?MS和TOF?MS/MS，高分辨的TOF MS通过PeakView进行目标化合物以及非目标化合物的提取或结构特征提取发现可能的中药成分，通过Formula Finder计算其分子组成，再结合高分辨TOF MS/MS进一步做结构分析，以确定化合物，分析流程如图2所示。

结果与讨论

目标化合物的筛查与鉴定

人参主要成分为三萜皂苷类，在负离子模式下，很容易产生加合离子，本实验的流动相中含有甲酸，人参皂苷的分子离子为加合醋酸的离子，根据苷元的不同分为二醇型皂苷和三醇型皂苷，其在负离子条件下产生三醇型皂苷特征性碎片475.38，二醇型碎片459.38，结构特点如图3所示。

使用PeakView软件中的XIC manager对人参皂苷目标化合物筛查，将人参皂苷目标化合物序号或名称和分子式信息导入到软件中的XIC manager，即可筛查目标化合物，可根据4大标准（保留时间、质量精度、同位素比例、谱库）判断筛查到的色谱峰是否为目标化合物。

图4. 人参皂苷类成分筛查结果。

利用已知的68种人参皂苷类成分，筛查到37种人参皂苷类成分，提取离子流色谱图、测得的精确质量数以及保留时间、强度和质量准确度简单直观显示出来，并同时根据获得的高分辨TOF MS和TOF MS/MS进一步的确证，筛查结果如图4所示。

人参皂苷中有多种同分异构体，仅通过高分辨的TOF MS不能确定，如人参皂苷Re & Rd分子组成均为C49H84O20，必须通过高分辨的MS/MS进一步确定结构。图5展示了根据人参皂苷的结构特点，并结合高分辨MS/MS对人参皂苷结构的推测。

图5. 推断左为人参皂苷三醇苷Re，右为人参皂苷Rd，各碎片的质量准确度均较高。

PeakView软件解析化合物的结构

根据一级质谱的质量精度、同位素比例、不饱和度等信息，运用PeakView软件推测可能化合物分子式，同时也能给出MS/MS的分子组成。在PeakView软件中导入化合物结构式，可对二级碎片结构进行预测。

查找结构相关化合物（NLF, PIF）

中药成分中同一类成分都具有相似的母核或结构特征，如会产生相同的碎片或具有相同的中性丢失部分，因此可通过中性丢失过滤（NLF）和产物离子过滤（PIF）查找结构相似的化合物。根据人参皂苷的结构特点，人参三醇苷能产生475.3的碎片以及人参二醇苷能产生459.3的碎片，可通过PIF找到满足特点的人参皂苷，同时可通过人参皂苷上结合糖的部分在ESI模式下，很容易中性丢失糖 162.053，146.058，可通过NLF来找到满足中性丢失六碳糖的皂苷类成分，满足这些特征的离子提取，同时满足条件的离子在TOF?MS上会以红色标记，同时得到的MS/MS可进一步进行确认，从而能够全面地完成人参皂苷类成分的分析鉴定。通过目标代谢物以及PIF、NLF方式，共鉴定出人参皂苷类成分45种，结果如表1所示。

小结

高分辨质谱具有简单的数据采集流程，可应对中药成分分析的要求，但如何在高分辨数据中快速发现和鉴定目标结构的化合物，已成为中药成份研究的限速挑战。凭借TripleTOF 5600系统的高扫描速度、高分辨以及高质量准确度，可同时获得高分辨的TOF MS和TOF MS/MS，能通过目标化合物提取以及PIF、NLF处理获得的高分辨数据，快速简便地查找到目标化合物。实验结果表明：所获得的各成分均具有较高的质量准确度，质量准确度均小于2ppm。