3-氯丙二醇测定新法

人们或许对此还记忆忧新：2002年，一个叫丙烯酰胺的名字引起了人们的不安和恐慌，晨读时咖啡和烤面包的芳香已不再美妙，反倒勾起了恐惧。而今，丙烯酰胺会改变动物的遗传并引发肿瘤已不再是新闻。和它类似的还有3-氯丙二醇（3-MCPD），尽管少了一些媒体的炒作，不如丙烯酰胺那样引人关注，白鼠试验却已证实了高剂量的3-MCPD会引发肾肿瘤。

丙烯酰胺和3-MCPD对人体健康的威胁有多大？由于目前仍有很多疑点没有得到充分的解答，因此至今尚无定论。但有一点是肯定的：这两种物质都不是天然存在于食品中，而是在生产或深加工过程中产生的。

图1. 25μl棕榈油提取液的LVI-GC-TOF-MS总离子流图。3-MCPD衍生物与基质成分的共洗脱使得目标峰难以分辨。

3-MCPD的产生

植物油的加工要经过一道工艺，称作精炼。传统的精炼分为4个步骤，是一些化学和物理的过程。在这些过程中，食用植物油及其油脂被加热到250℃，以除去一些会产生不良味道、气味和色泽的杂质，这样的植物油才能食用。然而，该工艺也是产生3-MCPD脂肪酸酯的主要途径：在高温过程中，一些油脂成分以及各种脂肪酸和氯离子发生反应，从而产生3-MCPD脂肪酸酯。

传统分析法的不足

根据动物试验结果，欧盟（EU）规定3-MCPD的限量为20μg/kg，欧盟专家则认为3-MCPD的日摄入量为2μg/kg是可以接受的。低限量要求对3-MCPD脂肪酸酯检测的灵敏度提出了挑战。气质联用（GC/MS）是目前最常用的检测3-MCPD的手段，然而GC/MS法存在一个严重的不足：大量的基质成分会同目标化合物一同被洗脱下来，给分析造成很大干扰。

通常鉴定食用油中3-MCPD脂肪酸酯采用的方式是将油或油脂水解后测定3-MCPD的总量，采用氘代内标3-MCPD-d5或其酯定量。样品在GC/MS分析前要进行各种前处理：水解、除脂肪酸（脂肪酸甲酯形式）、游离3-MCPD的盐析提取、苯基硼酸衍生处理以及溶剂的蒸发浓缩。这是一个耗时又费工的过程，与此同时，操作者还要小心避免因碱性水解或盐析产生负面结果的可能。碱性水解步骤会导致3-MCPD的分解，而盐析则会促成3-MCPD的生成，从而导致平衡的失调。

LVI结合二维GC分析

实践证明，大体积进样（LVI）可以明显提高分析方法的灵敏度。这是由于不分流进样模式只能进1~2μl的样品，而LVI的进样量可高达100μl以上。此外，采用LVI还可以省去蒸发浓缩以及盐析步骤，从而缩短样品前处理的时间。而峰容量过大和大量的背景杂质问题，则可以通过全二维气相色谱（GC×GC）来解决。为了保证二维色谱图中目标峰鉴定的可靠性和定量的精确性，所用质谱的采集频率不能低于100全谱图/s。目前通常采用可保证全谱图高速采集频率的飞行时间质谱（TOF-MS）。

本文着重探讨LVI与GC×GC-TOF-MS联用分析食用油中3-MCPD-脂肪酸酯的效率、可靠性和灵敏度。

图2. 25μl棕榈油提取液的GC×GC-TOFMS总离子流二维轮廓图。3-MCPD衍生物（红圈内）与其他基质成分清晰分开。

实验仪器

Leco公司的Pegasus?4D?GC×GC-TOF-MS、四射喷流加热调制器（Leco）、全二维气相色谱柱箱（Leco）、带有烧结玻璃衬管的OPTIC-3-程序升温汽化（PTV）进样器（Atas GL）。4D GC×GC-TOFMS由Leco的数据采集和处理软件Chroma-TOF进行控制和解析，PTV进样器由Atas GL的Evolution软件操控。第一维分离采用的色谱柱为瓦里安公司的VF-1ms柱（30m×0.25mm×0.25μm）；第二维分离则是采用VF-17ms柱（1m×0.1mm×0.2μm）。

大体积不分流进样

实验采用大体积不分流进样，进25μl样品（棕榈油提取物）后进行溶剂排空（40℃，20s，排空流量50ml/min），随后关闭分流阀，以5℃/s的速度开始进样口程序升温，加热至300℃。一维分离的升温程序为：40℃（1min），以6℃/min速度升温至90℃，再以20℃/min的速度升温至280℃（30min）。二维分离的炉温比一维分别高出5℃，即：45℃（1min），以6℃/min升温至195℃，再以20℃/min速度升温至285℃（30min）。调制周期为4s；TOF-MS采集速度为200帧/秒；质量数范围为50~500m/z；载气为氦气；流速为1ml/min。

样品前处理

将100mg均质的棕榈油样品称入带螺纹口的离心管中，加入500μl甲基叔丁基醚/乙酸乙酯混合液（8:2v/v）、250μl内标（3-MCPDd5，20μg/ml，溶于甲基叔丁基醚）及1ml NaOCH3溶液（0.5M）。1min后加入3ml异己烷，100μl冰醋酸及3ml氯化钠溶液（200g/L），LVI模式则不使用氯化钠溶液。振荡混合离心后，用移液管移去上层液体，余下水层再用异己烷提取一次，移去上层液体。在水相中加入250μl衍生试剂（5g苯基硼酸溶于19ml丙酮及1ml水），加热至80℃，持续20min后，放至室温下冷却。3-MCPD的苯基硼酸盐衍生物用3ml正己烷提取。提取液经蒸发浓缩后（LVI模式可省略该步骤），将正己烷浓缩液注入GC×GC-TOF-MS系统。

实验结果

为了将GC×GC-TOF-MS方法和文献中的一维方法进行对比，实验人员取一份棕榈油样品进行GC-TOF-MS分析。图1为25μl样品的LVI-GC-TOF-MS总离子流图，由此可以清楚地看到：3-MCPD-衍生物与基质成分共同被洗脱出来，难以分辨目标峰。相反，在二维方法的总离子流轮廓图（如图2所示）中，3-MCPD-衍生物与其他基质成分清晰地分开了。定量则采用内标法，在样品提取液中加入已知量的3-MCPDd5内标，制作等量同位素内标的目标物浓度梯度曲线进行定量。

上述定量法的缺点是：无论一维还是二维方法，3-MCPD和3-MCPD-d5都会同时洗脱出来，混杂的谱图使得3-MCPD-衍生物无法被准确鉴定出来。但是，TOF-MS具备谱图解卷积（TSD）功能，这意味着：尽管3-MCPD和3-MCPD-d5同时被洗脱出来，目标物的纯谱图却可以被分离出来，人们可以对这两种化合物进行准确的定量。为验证该方法的定量限（LOQ）和检测限（LOD），将样品提取液进样10次，检测结果如图表所示，浓度平均值为0.47μg/g，信噪比为1767。两种化合物的LOQ及LOD的计算如下：

LOD=（3/1767）×0.47=0.00080μg/g

LOQ=（10/1767）×0.47=0.00267μg/g

小结

实验测得3-MCPD的浓度标准偏差为2.7%。另外，检测仪器的稳定性也至关重要，分析此类样品时，一些仪器会遇到相关问题，如四级杆质谱的检测器会受到分析次数的限制，最多完成10次检测后，离子源就需要进行清洁和维护，以保证结果的重现性。而应用Pegasus系统则能避免这类问题的出现。为验证它的稳定性，研究人员根据上述方法做了100次平行测试，最终得出结论：100次检测的结果相似，仪器的稳定性并未受到影响。

大体积进样

作为传统进样法的替代，大体积进样（LVI）具备以下优点：提高了分析的灵敏度；操作者可省去蒸发浓缩及盐析步骤。需要注意的是，LVI在分析挥发性化合物时要进行优化设置。