探寻肿瘤标志物

本实验旨在应用iTRAQ试剂和MALDI-TOF/TOF对正常脑组织和退行性神经间质瘤样品进行蛋白质鉴定和定量比较。

实验内容

样品制备和iTRAQ试剂标记

4个样品分别为正常脑组织1、正常脑组织2、化学治疗非敏感肿瘤和化学治疗敏感肿瘤，分别用iTRAQ试剂114、115、116和117标记。每个样品50mg的组织粉末与1.5ml的裂解缓冲液（9.8M尿素，4%CHAPS，1mM PMSF，5μg/ml leupeptin，10mM NaF，2mM?Na3VO4，1mM?EDTA）混匀，冰上放置5min，匀浆，13000g离心5min。样品用TCEP还原，用碘乙酰氨烷基化。样品用胰蛋白酶消化过夜，酶解液真空干燥后再用iTRAQ溶解缓冲液（50mM碳酸氢三乙铵缓冲液，pH 8.5）溶解。然后用iTRAQ试剂114、115、116和117分别标记每个样品的肽段混合物，室温反应1h，再把标记好的样品混合，并加入10倍体积的SCX上样缓冲液。

强阳离子交换色谱

用强阳离子交换色谱分离组织蛋白酶解肽段混合物，分成11份。用0~500mM的KCl，10mM磷酸氢二钾，25%乙腈，pH3.0作为洗脱梯度液，梯度时间20min，流速1ml/min。收集11个馏分。

反相色谱分离

每个SCX馏分用LC Packing Ultimate液相色谱系统进行反相色谱分离，用100μm×15cm PepMap C18反相柱子，梯度设置：95%A（97.9% H2O，2% ACN，0.1%TFA）12min，95%A到50% B（85%ACN，9.9%H2O，5%IPA，0.1%TFA）。流速250nl/min。洗脱液直接用Probot Micro Fraction Collector点到MALDI靶上，每个点上收集12s。用MICROTEC配件将基质（7mg/ml CHCA，75%ACN，微量柠檬酸二铵）以2倍于洗脱液的流速在靶前混进洗脱液中，最后点到靶上。

数据采集与处理

用AB SCIEX MALDI-TOF/TOF质谱仪自动采集数据，每个MALDI点采集15个母离子做二级，利用空气为碰撞气体，碰撞能量为1KV。ProteinPilot 4.0软件分析数据，利用Mascot进行数据库检索。数据库为Celara fasta格式数据库。ProteinPilot 4.0软件计算每个iTRAQ试剂的报告离子簇面积，并给出结果。

结果与讨论

实验共鉴定了4594个肽段，对应1513个蛋白质，其中大于等于3个匹配肽段的蛋白质484个，iTRAQ试剂报告离子记数大于20，虽然严格的标准可能过滤掉一些潜在的标志物，但保证了蛋白质鉴定的高可信度，并提供了多个肽段的进行统计定量，保证了定量的准确性。根据蛋白质表达量在4个样品里的不同，将所鉴定的蛋白质分为4类：在两个肿瘤样品里都表达下调的；在正常和肿瘤样品里表达不变的；在肿瘤样品里表达上调的；在第2个肿瘤样品里表达上调的。结果分析发现角质纤维酸性蛋白（GFAP）相对两个正常脑组织样品和另外一个肿瘤样品在对化学治疗敏感的肿瘤样品里表达量很高。GFAP是神经角质瘤的标志物，3个不同的Annexin蛋白（A1、A5和A6）在化学治疗非敏感的肿瘤中都是表达上调的。

小结

本文应用AB SCIEX MALDI-TOF/TOF和iTRAQ试剂成功地对正常脑组织和退行性神经间质瘤样品进行了蛋白质鉴定和定量比较，共鉴定了4594个肽段，对应1513个蛋白质，其中大于等于3个匹配肽段的蛋白质484个。许多与脑功能相关的蛋白质在两种肿瘤组织里表达都是下调的，有几个蛋白质只在一个肿瘤样品里表达上调，包括化学敏感肿瘤的标志物GFAP蛋白，而Annexin?A1只在化学治疗非敏感的肿瘤中表达上调。