LC-MS/MS方法检测水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿

卫生部近日汇总公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单》，上海月旭公司从公布的黑名单中统计发现，包括三聚氰胺、苏丹红、孔雀石绿、人工合成色素等都在内。针对这些令人触目惊心的食品添加剂，同时也为食品安全检查和监管工作提供有力的技术支持和保障，上海月旭公司迅速组织相关人员研制出了方便、快速、准确的检测方法，现将LC-MS/MS检测水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿的方法公布如下：

1. 适用范围

适用于水产品(鱼、蟹、虾、甲鱼等)中孔雀石绿和隐形孔雀石绿的检测。

2. 提取

称取相当于原始样品5 g样品(精确至0.01g)制备好的试样，置于50mL塑料具塞离心管中，加入10µL 1μg/mL的混合内标标准溶液，依次加入1 mL 0.25 g/mL盐酸羟胺溶液、2 mL 1.0 mol/mL对甲苯磺酸溶液、2 mL 0.1 mol/L pH=4.5乙酸铵缓冲溶液，摇匀后，加入30mL乙腈，剧烈振摇2min,离心5 min(4000r/min)。将上清液转移到250mL分液漏斗中，用30mL乙腈重复提取残渣一次,合并上清液。于分液漏斗中加入50mL二氯甲烷,30 mL水，振摇2分钟,静置分层，收集下层有机层于250mL旋蒸瓶中。45 ℃旋转蒸发近干。

在旋蒸残渣中加入5mL 乙腈，漩涡振荡器，溶解残渣，待净化。

3. 净化

活化/平衡：将Welchrom® PRS 500mg/3mL (P/N：WSS46PR0305)安装在固相萃取装置上，上端连接Welchrom® Alumina-N 1g/6mL(P/N：WSAN010610)，用5 mL乙腈活化小柱，流出液弃去;

上样：将上述待净化液加入柱中，流出液弃去;

淋洗：用5 mL乙腈淋洗小柱后，弃去中性 Welchrom® Alumina-N小柱，然后将PRS抽干;

洗脱：5 mL乙酸乙酯：甲醇：氨水(50:45:5)混合溶液洗脱，收集洗脱液

40℃氮气吹干，1 mL流动相溶解，0.22μm针孔滤膜过滤后，待分析;

4. 色谱质谱条件

4.1 色谱条件

色谱柱： Xtimate C18 液相色谱柱(2.1mm*50 mm, 3 μm)

流动相：

A: 0.1%甲酸+2 mM乙酸铵水溶液

B：乙腈

梯度洗脱

流速： 0.4 mL/min

进样量： 10 μL

柱温： 40°C

运行时间：12 min

4.2 质谱条件

扫描模式：MRM

离子源：ESI+

毛细管电离电压：3000v

干燥气温度：350 ℃

干燥气流速：11 L/min

雾化器压力：50 psi

名称	母离子	子离子	碎裂电压（Fragment）	驻留时间 （ms）	碰撞能量 （V）	定量离 子对	定性离 子对
孔雀石绿（MG）	329.2	313.1	140	30	40	+	-
		208.1	140	30	38	-	+
隐性孔雀石绿(LMG)	331.2	316.1	140	30	20	+	-
		239.1	140	30	36	-	+
MG-D5	334.2	334.2	140	30	318.2	-	-
LMG-D6	337.3	337.2	140	30	322.2	-	-

5. 结果

5.1 回收率和重现性实验
将猪肌肉空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，添加浓度分别为0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/ kg、每批次内同一浓度做3次平行实验，共3个批次（样品典型回收率色谱图见附图）。

添加水平（μg/kg）
分析物	0.5		2		10
	Recovery (%)	RSD (%)	Recovery (%)	RSD (%)	Recovery (%)	RSD (%)
孔雀石绿	110.8	7.53	98.1	6.56	96.1	4.71
隐性孔雀石绿	95.3	7.43	103.5	3.42	97.4	4.55

图1 鳕鱼中添加0.1 mg/kg 盐酸克伦特罗EIC谱图 图2 鳕鱼中添加0.1 mg/kg 莱克多巴胺EIC谱图

本方法中使用到得耗材：

1. 固相萃取小柱 Welchrom® PRS 500mg/3mL (P/N: WSS46PR0305);Welchrom® Alumina-N 1g/6mL(P/N：WSAN010610)

2. 色谱柱：Xtimate C18, 2.1*50 mm，3μm(P/N:Xt3B18205)

3. 13mm，孔径0.22μm尼龙针孔滤膜(P/N: WEL-SFNY213022)

4. 12孔固相萃取装置(WEL-Vac-12)

来源：实验与分析