赭曲霉毒素A的HPLC检测

赭曲霉毒素是一种有毒并可能致癌的霉菌毒素，不少食品都含有这种毒素。赭曲霉毒素属次级代谢物毒素组群，由曲霉菌属 （Aspergillus）或青霉菌（Penicillium）的几种真菌产生，属于弱有机酸，为异香豆素的衍生物。赭曲霉毒素分为A，B，C三种；三者在化学结构上只有细微差异，但在毒性方面却有很大差别。赭曲霉A，B，C三种毒素中以赭曲霉毒素A（OTA）最为常见，毒性也是最强的，主要影响肝脏和肾脏。OTA主要存在于谷物、谷物产品、水果、咖啡、婴儿食品、葡萄干、葡萄酒和啤酒中,欧洲在整体膳食评估中对食品中OTA进行了分析,结果发现欧洲人从谷物中摄取到的OTA占到总摄取量的50%,因此，OTA在饲料中的污染情况日益受到人们的关注。

国家标准方法一般使用薄层色谱法对饲料中的OTA进行检测，但操作上人为因素影响大，重复性差，且使用的试剂毒性较大。本方法使用安捷伦Bond Elut Plexa PAX混合型强阴离子交换固相萃取前处理方法结合LC荧光检测器对饲料中的OTA进行分析，同样具有很好的选择性以及低的检测限，完全满足国家标准中对于饲料中OTA检测的要求。不同的添加浓度（在1~100ppb的线性范围内）OTA在饲料中的添加回收率范围均在85%~99%左右，RSD均小于2.2%，方法具有很好的准确度和重复性。

图1. SPE操作过程。

实验部分

仪器与试剂

乙腈，甲醇，乙酸均为色谱纯，甲酸，氨水为分析纯，试验用水为高纯去离子水；OTA标准品，10μg/ml甲醇溶液；饲料为配合饲料。

1260 Infinity HPLC，配FLD检测器，安捷伦；液相色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18 （4.6×75mm，2.7μm） PN. 687975-902；安捷伦Vac Elut 12固相萃取装置，P/N. 5982-9110；安捷伦可控针阀，P/N.12131005；安捷伦PTFE 15mm直径2UM过滤膜：P/N. 5190-5084；安捷伦Bond Elut Plexa PAX 200mg，6ml，P/N. 12107206 ，美国安捷伦公司；IKA 干磨机，A11 Basic Analytical Mill，配A11.2剪切刀头；IKA涡旋机，MS 3基本型。

图2. 连续6针进样OTA色谱图。

实验方法

标准品配制

工作曲线的的配置，取10μg/ml OTA标准品作为母液，用乙腈-水（40:60，含1%乙酸）溶液稀释分别配制浓度为1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml OTA标液制作工作曲线。

图3. 1ppb浓度OTA灵敏度谱图。

饲料样品前处理

将样品粉碎，称取5g试样（精确至0.01g），分别准确加入OTA标准溶液适量，混合均匀。准确加入20ml乙腈-水（60:40）溶液，涡旋1min，超声提取20min，在5000rpm的条件下离心10min。取上清液8ml，氨水调pH至8.0，待用。另做试样空白对照。SPE操作过程见图1。

仪器方法

高效液相色谱条件：Agilent 1260液相色谱仪，配FLD检测器；色谱柱，Agilent Poroshell 120 SB-C18 （4.6×75mm，2.7μm，PN. 687975-902）；流动相，A=1%乙酸-乙腈，B=1%乙酸-水，梯度洗脱，见表1；流速，1.0ml/min；进样量，20μl；柱温：30℃；运行时间，12min，后运行时间为4min；FLD，Ex=333nm，Em=477nm。

图4. OTA标准曲线。

结果与讨论

样品前处理方法的考察

OTA属于弱酸性化合物，其结构中的苯基丙氨酸部分的pKa=4.4，所以在上样前将提取液的pH调至8，OTA在pH大于7以上时基本以羧酸根阴离子状态存在，在上样时可以很好地被Bond Elut Plexa PAX以阴离子交换作用保存。然后采用4%氨水和甲醇分别洗去一些极性和非极性干扰物。试验结果表明PAX可以对OTA进行很好的保留和洗脱，且与反相机理相比，具有更好的选择性。

图5. OTA标准品、空白样品和添加回收率叠加色谱图。

仪器方法

本文用安捷伦1260 Infinity HPLC-FLD检测器，结合安捷伦专利的薄壳型快速分析色谱柱Poroshell 120 SB-C18 分析OTA，主峰出峰时间为8.84min左右，方法整体运行时间为16min，在方法流动相条件下最大系统压力仅为126bar，在连续分析几天样品后，色谱柱压力没有产生任何变化。这表明Poroshell 120系列色谱柱具有一定的耐脏性能，同时可以在常规液相色谱仪上实现高效快速分析。方法考察了样品溶剂效应，发现将进样体积增加到20μl时，如果用甲醇作为标准品溶剂，会具有很明显的溶剂效应。因此直接采用流动相作为工作曲线溶剂和样品溶剂。方法还考察了仪器的稳定性，六针重复进样的RSD为0.74%，具有很好的重复性，见表2。经过优化后的色谱图见图2。

仪器方法考察了灵敏度，线性范围及添加回收率等指标。其中灵敏度测试了1ppb浓度OTA标准品，其信噪比为10.7，结果如图3所示。在1~100ppb浓度范围内，测试线性相关系数大于0.9999。如图4所示。

方法的重复性

分别向空白饲料中，加入0.01、0.05、0.1μg/kg三个添加量的OTA标样，按照本方法的处理过程制备样品并进行测定，OTA在饲料中的绝对回收率在85%~99%之间，RSD在1.16%~2.15%之间，见表3；标准品、空白样品和标准添加样品的谱图如图5所示，可以看出OTA经Agilent Bond Elut Plexa PAX净化后，基本无基质干扰，可以达到很好的净化效果并且得到很高的回收率，提高了定量结果的准确性。

小结

利用安捷伦 Bond Elut Plexa PAX强阴离子交换固相萃取结合安捷伦1260 Infinity HPLC-FLD高灵敏度高选择性检测器，可以实现对饲料中OTA残留的定量分析。采用安捷伦Plexa PAX阴离子交换固相萃取，可以实现快速高效高选择性的净化处理，净化后的样品基质效应和基质干扰均很小，绝对添加回收率可达到86%以上；采用FLD分析结果表明在1ppb浓度下OTA的信噪比（S/N）=10.7；在1~100ppb浓度范围内,线性关系和稳定性都很优异，相关系数R>0.9999。