加速硝基咪唑残留的检测

硝基咪唑类药物（Nitroimidazoles） 主要用于预防和治疗家禽的滴虫病、猪的出血性下痢及厌氧菌感染，并具有促生长作用。是一类带有硝基的咪唑化合物，其性状为白色或淡黄色结晶，弱碱性，能和酸结合成盐，遇光易分解，易溶于甲醇，微溶于水。该类药物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性。常见硝基咪唑类药物包括甲硝唑（Metronidazole）、氯甲基硝唑（5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole）和苯并咪唑（5-Nitrobenzimidazole）等。这些药物在动物体内通过C2侧链的氧化而被快速代谢，代谢物与原药具有相似的潜在毒性。因此，欧盟，北美和我国等都禁止了硝基咪唑在食品动物中的使用。

为了测定鸡肉中的硝基咪唑类药物，根据国际方法GB/T 21318-2007，对样品进行前处理。这其中包含了很多步骤，如GPC净化和固相萃取等，过程较为繁琐。本研究使用美国LabTech公司全自动样品前处理平台，大大简化了这个样品前处理过程。平台由GPC凝胶净化系统、浓缩系统和SPE分离系统组成，即PrepElite-GVS系统，该平台不但能满足单一步骤的实验需求，还可以实现多个步骤的在线联机，明显简化了繁琐的样品前处理流程，减少了实验室工作量，并且提高了工作效率，保证结果的平行性和准确性。该平台具有良好的密闭性同时还具有溶剂回收功能，可保护操作人员免受有毒有害物质的危害，可广泛应用于环境、食品检测、农产品检测、生命科学等领域。

本文使用PrepElite—GVS全自动样品前处理平台对鸡肉中硝基咪唑类药物残留进行检测，使繁琐的前处理过程自动化，大大简化了人工操作，并且可以得到较理想的检测结果。

1、实验部分

1.1仪器与试剂

PrepElite—GVS: AutoClean全自动凝胶渗析色谱净化系统，附凝胶色谱柱Bio-Beads SX3，20×300mm；Sepline全自动固相萃取系统；LiqVap全自动定量浓缩系统（莱伯泰科有限公司，美国波士顿）；

LC-MS/MS 8030（岛津，日本）；

C18固相萃取柱（LabTech，1000mg/6ml）；

硝基咪唑类药物标准品：甲硝唑（纯度≥99.5%），苯并咪唑（纯度≥98%），氯甲基硝唑（纯度≥97.5%）；

乙酸乙酯（分析纯和色谱纯）,环己烷（分析纯）；氯化钠（分析纯），磷酸氢二钾（分析纯），无水硫酸钠（分析纯），甲醇（色谱纯），所用水均为超纯水。

1.2标样和样品处理

1.2.1标准溶液的配置

标准储备液：分别称取10.0mg标准品，用甲醇溶解并定容于10ml容量瓶中，该溶液浓度为1mg/ml，避光保存于-20℃。

混合标准中间液：分别吸取储备液1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，该溶液浓度为100μg/ml。

混合标准工作液：用水:甲醇=85:15的混合液稀释混合标准中间液到合适的浓度。

1.2.2样品配置

在超市购买新鲜的鸡胸肉样品切成小块，匀质混匀，制成肉糜。

1.2.3样品提取方法

称取适量试样，置于50ml离心管，加适量氯化钠和磷酸氢二钾，并用乙酸乙酯进行提取，超声10min，离心，收集上清液；再加入乙酸乙酯重复提取一次。合并收集液，用无水硫酸钠脱水，通过滤纸过滤。氮吹滤液，加入乙酸乙酯：环己烷（1:1）的混合液定容，供GVS净化。

1.2.4样品净化方法

在PrepElite—GVS全自动样品前处理平台软件上编制硝基咪唑类药物的净化方法如下。

GPC净化条件：运行时间，25min；检测波长，320nm；进样体积，2.0ml；收集范围，10.0min至20.0min。

浓缩条件：温度，50℃；溶剂置换，GPC流动相转为甲醇；定量浓缩终点体积，5.0ml。

SPE条件：活化，甲醇10.0 ml，流速3.0ml/min；氮气吹扫：3s；上样，体积4.0ml，流速3.0ml/min；洗脱，甲醇15.0ml，流速3.0ml/min；氮气吹扫，15s。

二次浓缩条件：温度，60℃；溶剂置换，甲醇转为水：甲醇（85:15）；定量浓缩终点体积，5.0ml 。

1.3 LC-MS/MS的条件

液相色谱条件

色谱柱：VP-ODS 150 ×2mm，2μm；

柱温：35℃；

流动相：A-0.1% 甲酸水溶液，B-甲醇；

流速为0.25ml/min，等度洗脱程序，A：B（85:15）。

质谱条件

电喷雾离子源正离子模式（ESI+）；

监测模式：多反应监测模式（MRM）参数，见表1；

脱溶剂管：250℃，加热模块：400℃；

雾化气流速2L/min，干燥气流速5L/min。

硝基咪唑类药物标液（200ppb）GVS净化后的TIC谱图，见图2。

2、结果与讨论

采用加标样品（加标浓度0.16mg/kg），经提取、GVS净化处理，并用LC-MS/MS分析，计算加标回收率及相对标准偏差。3种硝基咪唑类药物的回收率均在70%~100%之间，RSD均小于6%，见表2。

3、小结

本方法先对鸡肉样品中硝基咪唑类药物残留进行提取，并采用PrepElite—GVS（浓缩系统-GPC凝胶净化系统-SPE分离系统）全自动样品前处理平台进行GPC和C18固相萃取柱净化，最后用LC-MS/MS检测其中的硝基咪唑类药物残留，3种硝基咪唑类药物的回收率均在70%~130%之间，RSD均小于6%。实验过程自动化程度高，操作简单，结果显示数据理想，可用于常规的鸡肉中硝基咪唑类药物残留的检测。