分析尿液中的类交感胺类药物

根据DHHS与SAMHSA制订的尿液中各项药物测定的强制指南规定：初始药物测定通过免疫分析筛查5个药物类别（如安非他明、可卡因、鸦片、苯环利定和大麻），免疫筛查法包括放射免疫检测（RIA）及酶免疫检测（EIA，EMIT）等。免疫筛查样品测定结果为阳性需要进一步的色谱分离确证和质谱鉴定。SAMHSA规定5种氨基药物 （AMP、MAMP、MDA、MDMA和 MDEA）分析方法定量限近似为250ng/ml。

实验概述

确证分析尿液中的药物主要需进行以下7个步骤：

在尿液样品中加入氘代内标；

调节尿液的pH值；

水解尿液（仅鸦片和大麻）；

固相萃取（SPE）尿液中的药物，蒸发至干；

衍生萃取物（PCP除外）蒸发至干；

有机溶剂复溶；

注入1~3μl至气相色谱质谱联用仪，使用3离子比例的报告鉴定及定量测定。

图1. HFBA衍生工具的安非他明和甲基安非他明（100ng/ml尿液）色谱图。

玻璃器皿

所有的玻璃器皿，包括自动进样瓶和小体积的进样瓶内插管必须进行硅烷化处理，以防止样品吸附。将所有的玻璃器皿在10%DMDCS/甲苯溶液中浸泡10min，依次采用甲醇、正己烷清洗，然后风干。

实验试剂

PFPA=PFAA=五氟丙酸酐Campbell Scientific （Rockton，1L）；

HFBA=七氟酪酸酐Campbell Scientific （Rockton，1L）；

TFAA=三氟乙酸酐Campbell Scientific （Rockton，1L）；

醋酸100mM=2.86ml冰醋酸加入500ml的水中；

磷酸缓冲盐100mM pH6=1.7g Na2HPO4+12.14g Na2HPO4加入1L水中溶解，pH偏高用100mM NaH2PO4调节，pH偏低则用100mM Na2HPO4调节。

二氯甲烷/异丙醇/氨水（78：20：2） 萃取溶剂=40ml IP-OH+4ml conNH4OH+ 156ml MeCl2，每天新配。

药物标准品及氘代内标为Cerillant （Round Rock，TX），内标物：d5或d8-安非他明，d5或者d8-甲基苯丙胺。

仪器设备

气相色谱：PerkinElmer Clarus 680气相色谱；

进样口： 毛细管注射器使用压力脉冲无分流进样，250℃；

进样口衬管：SiltekTM带有玻璃毛（Cat. No.N6502010）；

气相色谱柱： Elite-5（5%苯基/ 9 5%甲基硅烷）12m×0.2mm×0.33μm（Cat. No. N9316110），载气He流速2.0ml/min；

气相炉温：60℃保持1min，再以40℃/min升温至300℃，保持1min，总计8min；

压力脉冲无分流进样：该程序是在进样过程中增加进样口压力，从而使更多的样品以很窄的带宽进入色谱柱，然后减少载气的流速至色谱的正常操作线速度。程序的时间设置如下：

在-0.71min，CAR2设置为5ml/min（进样之前增加压力）；-0.7min SPL2设置为0（无分流进样）；

0.7min CAR2设置为2ml/min（进样后正常流速）；0.8min设置SPL2为50（进样后，打开分流阀）。

质谱：PerkinElmer Clarus SQ 8 MS， 270L/sec分子涡轮泵，EI模式。选择离子监测（SIM）模式采集数据，每个离子采集20~50ms。主要离子用于鉴定和定量分析，另外两个离子用于确证及鉴定。3个离子色谱峰的顶点必须在标准品扫描的保留时间±2之内，离子比例与标准品的离子比例相差不超过20%。氘代的内标可以仅选择两个离子：一个主要离子和一个确证离子。

图2. PFPA离子的质量色谱图叠加。

固相萃取

采用高分子树脂的固相萃取（SPE）柱从尿液基体中萃取药物，当尿液样品通过树脂柱时，药物被保留，清洗树脂柱床除去盐及其他的干扰物。使用较强的溶剂将药物从树脂柱床中淋洗下来，以完成样品的净化。萃取柱使用Supra Clean SPE柱。

实验步骤

萃取程序

1~2ml尿液样品+内标+2ml 100mM磷酸缓冲盐（pH6）。

SPE柱萃取

先后用3ml甲醇、3ml水分别淋洗萃取柱，然后加入1ml磷酸缓冲盐（pH6）。

加入样品，分别使用3ml水，1ml 100mM的乙酸乙酯，1ml甲醇清洗。

利用3ml二氯甲烷/异丙醇/氨水（78：20：2）淋洗萃取柱，收集萃取溶液至离心管中。

小于50℃蒸发至干，50μl衍生化试剂复溶，N2氛围，盖紧，混匀，70℃加热20min，小于50℃蒸发至干。100μl乙酸乙酯复溶，转移至自动进样瓶的内衬管中，进样1μl。

有很多衍生化试剂可以使用，每种产生不同的离子，主要衍生化试剂有：PFPA， HFBA， TFAA等。

PFPA的SIM离子

Amp：190，118，91；

d5-Amp：194，123；

d8-Amp： 193，126；

RT：3.11min；

Mamp：204，160，118；

d5-Mamp： 208，163

d8-Mamp：211，163；

RT：3.49min。

HFBA的SIM离子

Amp：118，240，91；

d5-Amp：244，123；

d8-Amp：243，126；

RT：3.29min；

Mamp：118，210，254；

d5-Mamp：258，213；

d8-Mamp：261， 213；

RT： 3.59min。

TFAA的SIM离子

Amp： 118，140，91；

d5-Amp： 144，123；

d8-Amp： 143，126；

RT： 3.10min；

Mamp： 154，118，110；

d5-Mamp：158，113；

d8-Mamp： 161，113；

RT：3.48min。

注意

PFPA蒸发致干较HFBA容易，50℃时可在5min之内蒸发；HFBA/TFAA以1：9稀释在己烷里能蒸发得更快；若有羟基存在，PFPA将会溅射，因此衍生前样品应该干燥且没有醇存在。

校准范围

方法确证近似水平=250ng/ml。10%（25ng/ml），40%（100ng/ml），100%（250ng/ml），125%（312.5ng/ml），500%（1250ng/ml）和1000%（2500ng/ml）。

实验结果

图1为HFBA衍生工具的安非他明和甲基安非他明（100ng/ml尿液）色谱图，图2为PFPA离子的质量色谱图叠加。定量限：2ml尿液25ng/ml；检测限：2ml尿液＜2.5ng/ml；线性相关系数（R2）＞0.999。

小结

本文建立了符合美国联邦药物测试项目要求的尿液中安非他明的分析方法。法医和临床实验室可以应用同样的方法测定毒理学样本中非限制药物。通过使用较短的气相色谱柱，较快的流速进入质谱，较快的气相色谱炉温降温速度及自动进样器的预清洗程序，从而提高了样品的通量。Perkinelmer公司Clarus SQ 8 GC/MS的操作系统在SIM扫描模式时，给出了灵敏可靠的色谱数据。本实验还应用了TurboMass GC/MS软件包括3离子比例确证的计算及简单易懂的数据报告模板。