图解光诱导荧光蛋白系统

GFP蛋白曾经为蛋白质定位等相关研究带来革命性的进展，而随着具有和GFP类似遗传学特征的光学指示剂蛋白的出现，蛋白质相关的动态研究也将获得更多的手段和技术，本文详细介绍了激光诱导荧光系统在蛋白质研究中的应用。

近年来随着蛋白质学研究的进展，研究人员相继发现和特异克隆了一些特殊蛋白质。这些蛋白具备和GFP（green fluorescence protein，绿色荧光蛋白）类似的遗传学特征，可以质粒方式转染或共转染到细胞中，随后可以独立表达或和其融合的蛋白一起表达，并几乎对其标记蛋白的功能和定位没有任何影响。这些蛋白的另外一个显著的特点是其在特殊的激光刺激下会产生一些特异性的变化，如亮度变化、颜色变化等。随着这些蛋白的产生，一些以往难以操作，甚至不能完成的科学研究已经变为可能。这些研究包括：荧光团、荧光抗体和GFP融合蛋白等标记的膜成分扩散运动；膜蛋白及脂质成分研究；亚细胞膜；脂质重建；细胞质内扩散运动；胞间信息交换；检查内质网、细胞核和细胞质等区室边界等。

根据其引发变化不同，激光诱导相关研究可以大致分为两大类，一类是通过改变荧光染料荧光亮度来实现，包括光漂白和光活化，其中光漂白主要有FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleach）和FLIP （Fluorescence Loss In Photobleach）两种技术，光活化以PA-GFP/ Dronpa/ uncaging为代表；另一类是是通过改变荧光染料颜色实现，主要是以Keade为代表的光转化。

光漂白后恢复FRAP

光漂白后恢复（FRAP，Fluorescence Recovery After Photobleach）经常用于分析多种生物膜系统。FRAP是用较强的激光将微米大小区域的荧光完全漂白，在被漂白区和未漂白区之间形成明显荧光亮度反差，随后研究者可以持续观察两个区域之间的相互运动。只有漂白区和未漂白区荧光分子之间存在交互扩散运动，光漂白区才能重新出现荧光，通过分析漂白区域的荧光变化可以推测出膜蛋白的动力学特性。

FRAP结果表明，多数膜蛋白并不是在胞质或质膜上的随意扩散，生物膜上蛋白质的扩散存在许多限制条件，主要包括：膜分子之间、膜分子与胞质及胞外基质分子之间的相互作用。对于特定蛋白分子来说，其运动状态和组分体现了细胞骨架、细胞质、脂双层的粘度和其他膜蛋白对它的综合限制作用。利用FRAP技术定量研究分子运动的物理性限制作用，将有助于我们更深入地了解细胞内蛋白质和脂类分子的特性、相互作用甚至生理功能。

荧光漂白消失FLIP

一些标本或标本的不同部位如：细胞核膜、内质网和细胞质等，荧光恢复的速度非常快，荧光漂白与恢复几乎同时发生。而使用FRAP实现微观动力学的过程中，必须分为漂白和漂白后两个过程，两个过程之间的转换存在时间延迟，所以FRAP实验无法实现这些快速变化标本的动力学研究。荧光漂白消失（FLIP，Fluorescence lose in Photobleach）与FRAP类似，同样在细胞上选取局部刺激区域，用强激光反复刺激，不同之处是FRAP记录的是被漂白区域的荧光恢复过程，而FLIP记录的是未被漂白区域的荧光损失过程，该技术为检查内质网、细胞核和细胞质等区室的边界提供了强有力的工具。

FLIP技术要求提供尽量同步的刺激图像获取，现有绝大多数设备无法满足甚至接近该要求。2004年底OLYMPUS公司新开发的FV1000光诱导系统采用了突破性SIM（同步）技术，分离出一束与取图激光独立的激光照明系统，可以在取图的同时对标本特定部位进行刺激，无须切换XY扫描振镜的扫描模式，可以真正实现同时刺激，同时观察变化。避免了传统使用共聚焦显微镜必须在局部刺激扫描和整体动态图像获取之间的反复切换的时间延迟和低刺激效率。同时其刺激激光采用了短光路和龙卷风扫描模式，极大地提高了光漂白的效率。

光学诱导荧光蛋白

发现荧光蛋白并利用基因工程对这些蛋白进行重组和优化后，扩展了生物学家的研究手段，他们可以在更广泛的空间和时间分辨率内对活细胞进行观察，并可以进行细胞内分子追踪、分子定量等研究，从而可以分析活细胞中蛋白质分布、运动、衍生物情况和生物化学特性。蛋白质功能研究已经被公认为继测定基因组序列之后最重要的细胞活动研究重点。

下面将以三个典型的光诱导蛋白为例说明其独特的光学性质和其非常适合生物学研究的特征。

光活化荧光蛋白PA-GFP

第一个被设计用于光活化研究的光学指示剂是一种Aequorea victoria 水母的蛋白突变体，叫做PA-GFP（分别取photo和activatable的首字母）。这种GFP蛋白的光活化突变体是将野生型中性蛋白质改造为阴离子态得来的。在稳定状态（unperturbed state）时，野生型绿色荧光蛋白在395和475nm处分别有一大一小两个吸收峰。当用强紫外或紫光照射该蛋白时，发色团产生光转化，从而改变了大小两个吸收峰的相对消光系数的比值。结果是在488nm激发下，发射荧光的强度比未刺激前增加了3倍。

图1. 由上至下分别为FRAP、FLIP、光活化。

通过突变技术的PA-GFP降低了475nm处的吸收峰，在450~550nm处的吸收几乎可以忽略不计，同时增强近紫外（约400nm）照射下野生型光转化效率。因此极大增加了非活化和活化状态之间的反差。光活化后，PA-GFP在504nm处的最大吸收增加了约100倍。这一现象极大增强了转化和未转化PA-GFP之间的差异，以此可以最终观察其在细胞内的动态变化（见图2）。

图2. 三种典型光诱导蛋白。

图3a显示了光活化前后的PA-GFP吸收和发射峰曲线。图中标明了用于光转化的激光波长（箭头所示）和宽场弧光灯激发波段（黄色框）。图3a中的活化后荧光发射曲线是在488nm激光激发下得到的。用405nm固体激光器可以激发目的位点，如图3b所示。光活化后，绿色发射荧光的强度会明显上升，如图3c所示。

图3. PA-GFP谱线和光活化特性。

PA-GFP的光活化可以用来标记选定分子或整个细胞，并利用延时图像技术获取动力学特征。在理想状态下，只有活化的PA-GFP分子发射醒目的荧光，新合成的蛋白不会对实验造成影响。PA-GFP的光活化会比利用GFP进行光漂白研究的速度更快、现象更明显，而且用于光活化的激光强度要远小于FRAP的漂白激光，对细胞的杀伤相对较低。因此该项技术非常适合活细胞中蛋白质的动态研究。

但需要注意的是在光转化后，PA-GFP和野生型GFP荧光在488nm激发下都会表现同样水平的增强。但从另一方面讲，在未被光诱导（如405nm激发）前很难区分细胞是否表达PA-GFP，所以用显微镜很难提前确定确切的表达区域。

可擦写光学蛋白Dronpa

从Pectiniidae（一种石化珊瑚虫）中提取的单体荧光蛋白Dronpa 预示了新一代的可开关特殊荧光蛋白的诞生。Dronpa表现出了与众不同的光变色性能，它可以用两种不同的激发光控制荧光的开和关。

Dronpa荧光蛋白惊人的特点是可以在488nm下快速漂白，并且随后又可以在405nm激发光刺激下完全恢复。这种模式的光漂白和活化可以反复进行。

图4显示了转基因细胞中Dronpa蛋白在光漂白和光活化之间的可逆转换。该细胞被转染了只含有Dronpa蛋白基因（没有其他融合基因）的质粒并在细胞培养瓶中培养。最初在488nm下标本显示很明亮的绿色荧光（图4，0s），50~60s后亮度逐渐衰减（图4，0~55s）至检测不到。荧光衰减曲线如图4a中绿色曲线所示。用405nm近紫外激光活化后，Dronpa 蛋白的荧光强度恢复（图4，紫色曲线）。同样方法反复光漂白和活化重复10次以上的图形（图4b）显示，多次反复后Dronpa荧光的恢复会有一定的衰减。10次循环后，Dronpa 荧光减少为原来的88%左右。

图4. Dranpa蛋白的光学特点。

光诱导变色荧光蛋白KEADE

目前已经从珊瑚虫和海葵中提取和开发出了许多有应用潜力的光学指示剂。其中一个非常重要的是Kaede蛋白，受紫外激发后这种蛋白会产生从绿色到红色的光转化。光转化后，红/绿比会显著增加约2000倍（红增、绿减）。这一类具有独特颜色转换特性的光学指示剂会成为亚细胞器乃至整个细胞光学标记的最佳选择。

图5显示的是光转化前后Kaede 蛋白的吸收、发射光谱曲线和细胞中两种颜色荧光融合的动态图像。分别用绿色的虚/实线代表转化前Kaede蛋白的吸收/发射曲线，用红色虚/实线代表转化后Kaede 蛋白的吸收和发射曲线。由图可以看出，经过光诱导后红和绿两个荧光发射峰之间的差异非常明显，发射峰值距离约为60nm。图5a到图5d数码图像为我们展示了光转化前Kaede的绿色荧光，见图5a，用405nm激光对选择区域进行短时间激发，如图5b中红色部分所示，转化后Kaede蛋白逐渐扩散到整个细胞但没有进入细胞核的动态图像，见图5c和图5d。

图5. Keade蛋白的光谱特征和光转化特点。

利用Keade蛋白在光转化前后的明显颜色变化，研究者可以持续追踪红色荧光的动态变化，进而描述出其标记的动力学特征。利用这种显著的颜色差异，这种蛋白还更多的被用于区分特异细胞和周围类似细胞的实验中。

实验操作要求

在光转化和光活化实验中，选择感兴趣区域进行刺激的比较理想的操作方法是使用生光调制器（acousto-optic tunable filter，AOTF），用它可以非常方便地定义圆形、椭圆、方形和其他自由形状区域对标本进行光刺激。

但使用共聚焦和AOTF方法研究光转化或光活化反应存在重要缺陷：刺激和取图要共用同一对XY扫描振镜，所以刺激和扫描只能分开在不同时间段进行。这样操作存在几个弊端：第一，刺激的同时无法观察细胞反应；第二，无法确定细胞确切的受诱导状态，经常需要在刺激和取图之间反复切换，以获取最佳的诱导状态；第三，由于在AOTF/ZOOM诱导和常规取图之间切换有明显的时间延迟，所以该方法对快速反应无能为力；第四，刺激激光和取图激光都使用XY振镜，并且使用同样光路，所以刺激速度和效率都受到限制。

OLYMPUS公司新引进的同步双扫描系统——FV1000-SIM，为光学指示剂及快速解笼锁、FRAP和FLIP等研究增加了新的手段。该系统除XY扫描振镜外，另外引入一个同步扫描头，新的扫描头与XY振镜各自独立工作，只进行光刺激功能。这样就解决了以往用AOTF或ZOOM方式进行光刺激工作时必须在取图和刺激间频繁切换的问题，提高了刺激效率、节省了操作时间。最大的优点是可以在刺激标本的同时，不影响正常的图像获取，可以在刺激的同时看到标本的瞬间变化，为FLIP/FREP/Keade蛋白/PA-GFP蛋白/解笼锁（uncaging）等光刺激研究提供了最佳的解决方案。

鉴于前些年GFP蛋白为蛋白质定位等相关研究带来的革命性的进展，相信具备更佳性能的光学指示剂会为蛋白定位研究，尤其与蛋白质相关的动态研究带来更为显著的推动作用。

来源：实验与分析