全自动离线二维LC纯化蛋白

多维液相色谱在蛋白质组学研究领域中已成为一种成熟的用于分离复杂样品的分离技术。结合离子交换与反相色谱的二维液相常以离线或在线的形式被用于蛋白及多肽的分离中。在线方式虽具有分析自动化程度较高等优点，但比较而言离线方式具有更佳的分离性能；更高的方法灵活性，能方便地针对每一维优化分离条件；对于蛋白质组学领域的研究者而言，更高的分离效率、更高的选择灵活性意味着更宽阔的视野，更高的工作效率。

本文从蛋白质组学研究中最常见的两种策略Bottom-up及Top-Down入手，介绍全自动离线多维液相色谱系统在蛋白质组学前端分离中的应用，包括分离复杂多肽混合物及混合蛋白质方面的应用。现在纳升级液相色谱已在蛋白质组学研究领域中的地位非同一般，是蛋白质组学研究中质谱分析，特别是高端质谱分析的最佳前端分离工具。戴安公司（Dionex Corp.）是该领域的佼佼者，其纳升及毛细管级液相产品源自荷兰的LC-PACKING公司，LC-PACKING在分流技术领域有雄厚的研发实力，并于1998年就推出了第一台纳升级高效液相色谱。目前已推出基于UltiFlow技术的第三代分流装置，使仪器的性能达到一个全新的高度，并在与不分流技术的竞争中处于绝对领先的地位。

戴安公司最新的UltiMate3000全自动离线多维液相色谱系统配备了一套集进样与馏分收集两种功能于一身的进样装置（见图1）；同时提供两套独立的梯度泵，分别用于第一维与第二维的分离；配以Cap或Nano分流器，极其方便地获得从纳升到毫升级别的流速范围，使得用户可以灵活地选择不同类型以及不同级别的色谱柱，为方法开发带来极高的便利，见表1。

图 1. 自动进样器的8通阀；同时用于进样及馏分收集。

此外，戴安公司变色龙?软件具有的2D-LC Plot功能可将二维的色谱图按保留时间转化成模拟二维电泳胶图，方便使用者更直观的分析数据。

CAP SCX / CAP Monolithic分离多肽

在本实验中，两维分离均采用毛细管色谱柱，这就意味着一个分流器需同时满足两维分离的需要，分流比为1:100，系统流路图如图2所示，通过程序控制的阀自动切换，完成整个离线二维从第一维的离子交换－馏分自动收集－第二维反相分离的全过程自动分析，分离结果如图3、图4所示。

图2. 2D – Cap LC SCX-RP 的设置。

图3. 多肽在第一维 SCX 柱上的分离。

图4. 多肽馏份在第二维 PS-DVB 整体（Monolithic）反相柱上的分离。

2D-LC plot

复杂样品通过二维液相色谱分离后获得的三维数据(第一维分离时间-第二维分离时间-响应值)可根据保留时间转化为以保留时间为横、纵坐标的类似于电泳胶图的2D-LC plot图，结果见图5。

图5. SCX 馏份的 2D-LC Plot。

讨论

全新的自动离线二维液相色谱系统为使用者提供了多种可选择的分离模式组合，在极大的方便用户进行方法开发的同时，也保证了每一维分离具有极高的分辨效率，为后期质谱鉴定提供更高的可信度（见表2），带给研究者更丰富的样品信息，这一点对于蛋白质组学研究领域的研究者而言尤为重要。同时，全自动的智能液相系统配以具有领先技术的整体（Monolithic）色谱柱，保证在每一维的分离过程中同时具备很高的分辨率与分析速度，大大节省了研究者的宝贵时间，提高了通量，以本实验为例，完成含20个二维组分的分离总时间不到9h。

Micro WAX / CAP Monolithic分离蛋白

本实验中，第一维分离采用弱阴离子交换，第二维采用Monolithic反相分离，系统流路图如图6所示，整个分析过程通过程序控制的阀门自动切换完成。分离结果如图7、图8所示，由二维色谱图转化为2D-LC plot图如图9所示。

图 6. 2D-LC WAX-RP 的设置。

图7. 蛋白在第一维 WAX 柱上的分离。

图8. 蛋白馏份在第二维 PS-DVB 整体（Monolithic）反相柱上的分离。

图9. WAX 馏份的 2D-LC Plot。

结论

以上实验结果说明，全自动离线二维液相色谱系统能满足蛋白质组学研究中多种分离模式的需要，配以具有极佳分离效率的离子交换系列色谱柱以及Monolithic系列整体柱，在能给研究者带来更优异的分离效率的同时，减少了分析时间，是蛋白质组学研究前端理想的分离工具。