FT-NIR原材料鉴别技术及其应用

在质量控制（QC）实验室中进行的原材料鉴别是一件枯燥而又费时的工作。而且，欧洲规定对原材料容器要进行100%的ID测试，这大大提高了QC实验室工作的复杂性。虽然常常陷入空间太小、设备有限而且缺乏熟练的操作人员的困境，但是QC实验室仍会按照新的规定处理与分析大量的样品。因此会导致实验室样品大量积压，从而增加原材料库存，延长生产周期。新的FDA PAT（Process Analytical Technology） 技术为试验人员将优良品质融入成品中创造了条件，试验人员不再像往常那样仅仅检测成品的质量。提高加工过程品质的关键是要注意原材料、生产过程与环境变量之间的联系以及它们对质量的影响。PAT结构的目的是设计和开发在生产过程后期始终符合预期质量要求的加工过程。FT-NIR技术可提供有关物理（如：颗粒大小、形态等）和化学性质的重要信息。这类分析通常是指“赋予资格”，而不是“鉴别”。使用资格鉴定方法时，必须仔细比较样品与标准品的光谱特征，而不是象在ID分析中那样，仅仅进行光谱匹配操作。该技术通过阻止低劣原材料进入生产链，从而最大限度地降低了次品量以及检测所花费的大量成本。ABB所开发的NIR解决方案大大改善了可完全流入生产的原材料的质量控制效果。对原材料的分析可在卸货码头直接进行，也可在实验室进行。而且NIR分析无需样品制备，无破坏性，不产生废料，消除了操作偏差，大大减少了有效药物的暴露时间。

NIR分析仪可由非熟练工操作，在5~10S之内即可完成分析，而熟练技术人员则可解放出来从事其它的工作。

NIR解决方案在电磁波频谱上，近红外线(NIR)辐射位于中部红外线（MIR）与可见光谱（VIS）区之间，其频率为14,286～4,000cm-1（700～2500nm）。近红外光谱是分子振动的泛频与合频跃迁。最敏感的NIR谱带为O-H, C-H和 N-H伸缩振动。固体通常通过漫反射方法测量样品散射光与参考之间的强度比，因为NIR范围内的吸收率较低，光通常可以进入材料的深度为1～3mm，从而取得比中红外区域更多的典型样品，因为中红外线的光只能探测到5～10mm。反射光被检测出来后以光频率函数的形式绘制出来。而液体通常采用透射方式测量。当光通过样品时，测量所减弱的光强度并以此作为波长的函数。在NIR区域内，玻璃实际是透明的，所以当工作区选择在NIR范围时，可以使用便宜的玻璃容器，也可以用高分子薄膜和薄的袋子作为样品容器，以避免样品与取样辅助仪器直接接触。同时，可使用含低OH的石英光纤远距离（100m或更长）传输光线。这些特点使得NIR分析方法比MIR要简单的多。NIR可以测量有机固体和液体，也可以测量复合无机盐或水合无机盐。同时，还可以对无机酸进行测量。测量时可以把一个反射标准样品放置于薄膜后面，通过其漫反射参比分析填料与薄膜。油脂、透明以及粘性大的材料可在溶化后用透射方式测量。如果乳状液与分散液含有至少10%的有机相，也可以用透射方式测量。另外，分子的氢键、分子外部键以及分子内部键对温度非常敏感，因此NIR光谱会受到温差的影响，样品的温度也会对测量结果有一定的影响。所以在测量过程中需要控制温度的变化以确保测量的准确性，尤其是对水溶液而言。如果根据粘度来判别材料，也必须进行温度控制。FT-NIR原材料鉴别技术是通过使用化学计量方法为特定材料建立校准模型以获取并处理材料的NIR光谱来进行的。为了保证鉴别的确定性，结果必须符合预先定义好的验收标准。另外，可以根据数据库中该特定材料所有的验证模型预测它的光谱以避免假阳性或重复鉴别。可以使用多个算法构造二十个模型，如：波长的相关性，主成份分析（PCA）以及偏最小二乘法（PLS）等。PLS和PCA算法根据标准光谱产生一系列的权重特征向量或系数。每个因素对应于标准光谱的一次改变。然后使用这些因素的线性组合重新构造标准光谱。用以重新构造光谱的每个因素的数量称为得分。重构完成后，剩下的部分称为光谱残差。可以为每个相关的因素设置分值范围与光谱残值极限，并专门为PLS设置预测值极限。对于每种情况，当建立模型以证明不同组之间的显著区别并保持材料的组属性时，这些极限的确定都应建立在对数据统计分析的基础上。PLS高效的鉴别能力使出现假阳极鉴别的概率极小，所以ABB使用单独的PLS模型。这样，我们便可以假设不同类之间的变化很好地控制总体的变化。它成功的应用是因为构造了负责主要类变化的PCs，但是在实际应用中却遇到其成员中类似化学样品类内部变化的问题。在这样的情况下，PCA模型不能保证能得到所需的鉴别结果，并有产生假阳极结果的危险。另外一个选择就是适当独立的类推分析（SIMCA）。这是PCA鉴别分析中推荐使用的方法，因为它为每个类建立了独立的PCA模型，从而能够使用类成员。然而，在建立该模型时仍然没有考虑到其它的类。这意味着在每个类的模型中，有些因素在获取类中明显的变化时只能反映出有限的鉴别信息。当多维数据（比如NIR）不同类中的子空间都非常接近时，由于类之间不必要的重叠，从而有非优化的鉴别模型产生的危险。单独的PLS模型是鉴别分析中非常好的选择，因为在构造因素时考虑到了辅助矩阵以代码形式提供的类成员信息。成员指示变量（如波长频率）的选择与预测是提高因素可分离性的一个有效途径。运行情况仪器配置有两种仪器配置方式可供选择。如果因为样品有毒、易吸潮或性质不稳定不能打开样品容器，或者为了加速分析的过程不把样品带到化验室时，可使用远程取样方式。测量远程固体样品时，ABB的FTLA2000-PH30配置了一个固体漫反射检测（ACC102）的光纤探头, 漫反射探头可以通过聚合物袋子、板材或玻璃分析样品。测试液体时，配置一个可控制任意温度的一次性玻璃小试管检测套件（ACC118，131或132）。 在分析可以带到化验室分析的样品时，可使用FTLA2000-PH20系列标准系统。该系统在测试固体样品时配置了一个内置式漫反射检测套件 (ACC101)。另外，在样品的分析隔间上或仪器测孔上放置一个任意温度控制玻璃小试管检测套件（ACC118，131或132），可以分析一次性玻璃小试管中的液体。在分析凝胶体、膏状物、浆糊以及其它类型的样品时可使用其他辅助套件。 取样固体取样可以使用三种不同的技术。

图1 用玻璃小瓶对粉末状样品取样分析

图2 液体取样

■　直接接触可获得最佳光谱，但执行起来却很困难，因为每次取样后都得清洗辅助仪器，所以大大增加了样品间交叉污染的可能性。■　利用LDPE袋子或薄片这些材料将吸收一些NIR光（脂肪族C-H区域），建立对聚合物厚度、质量以及颜色几乎完全不敏感的标准模型。为了得到这些性质，可以从标准中除去特定的塑胶谱带。另外一个选择就是在分析前对某个典型的LDPE进行自动数学减法操作。使用这两种方法可以区分大部分的材料，但是可能不能区分那些分子链长的或粒度差别很小的材料。■　通过玻璃小试管或玻璃瓶在NIR中，玻璃是透明的。所获取的光谱与通过直接接触所获取的光谱是一致的。玻璃应该很薄（最好1mm或更薄），因为玻璃厚度的变化将导致光谱的偏移，不过这种偏移通过平坦基线很容易矫正。同时，玻璃应该清晰或颜色很浅，因为NIR对于频率大于6000～7000 cm-1的琥珀色瓶的吸收率很高。液体取样可使用不同直径的、带有液体取样检测套件（ACC118, 131或 132）的一次性硼硅酸盐玻璃小试管取样。一次性玻璃小瓶消除了交叉污染的危险。使用波长校正可成功补偿玻璃小瓶内径的变化，不会因使用不同玻璃小瓶取样所获得结果的可重复性与使用单个小瓶的可重复性不一致。因为玻璃材料是惰性的，因此使用玻璃对腐蚀性的化学品取样时灵活性很大。温控件测套件的温度应控制在±1℃之内以确保严格鉴别时光谱的再现性。仪器验证和维护ABB为每种取样所配备的所有检测套件完全符合IQ和OQ协议。同时，它们也为软件验证做了存档，并符合最新的EP，USP，PASG与GAMP标准。整个OQ协议的执行可在10~15min之内完成。与分析技术轮换一样，FT-NIR仪器无需太多的维护。定期维护需要每6个月更换一次红外光源，每3年替换一只激光。原材料鉴别程序的执行建立单个鉴别模型需要以下四个步骤■　库方法（单个模型对通用模型）一般模型方法使用单个模型作为所有库中材料鉴别的基础。此方法必须在所有参数中取得折中，它主要集中在集合的整体而不是集合的某个成员上。其优点是计算速度快。缺点是不够稳固，建立的工作量大，更重要的是添加其它材料时需要重新构建整个模型并重新验证。在通用模型系统数据库中添加新的材料时，整个库都需要重新验证以确保特性的连续性。单个模型方法使用独立的模型来区分不同的材料组。每个模型都有其独立的鉴别标准。选择每组的最优数据预处理/传输程序以及鉴别标准后，类之间的间隔便被最大化，同时类内部的变化也被最小化，为了提高鉴别的能力，推荐使用该方法。另外，因为每组材料是独立计算的，所以加入新的材料组或修改某个组时不需要对所有的组重新优化和重新验证。该方法只简单的为某个新组建立模型并将其添加到已有模型列中，或用新验证的模型替换已有的模型而不需对整个库进行重新验证。在大部分的应用中，使用个别模型比通用模型更有效。■　光谱相似性分析要正确地建立和验证NIR ID方法，需要两种样品：一种用于模型的建造，另外一种用于验证。以PLS作为标准，数据库必须由至少两种不同的材料光谱类构成以便在相似的材料中进行高效辨别。此过程可以通过化学方式完成，即以材料的化学式为基础将材料放入相应的组/族中。材料通常分成液体和固体两类，再根据它们的功能团如酸、醇、胺等分类，最后根据它们的物理性质如链长、粘性、粒度等分类。 ■　鉴别材料选择鉴别方法的标准使用PLS，数据库必须至少由两种不同的材料类构成：用于鉴别的目标材料和鉴别材料。 以鉴别材料为基础，修改因素使体现两种材料性质差异的相关性最小。 这与其他的多元算法（如PCA）是不同的，因为其它多元算法的向量只表示数据集内最常见的光谱变化。比如，某种特定原材料的光谱变化可能主要来源于材料中的水分。使用PCA（如SIMCA）时，与氧-氢键联系的光谱区应该在ID模型/方法中作为最重要的因素考虑，如果想得到同样有水分变化的原材料鉴别等级，这也许不是最好的，因为它不是目标材料的明显特征。 PLS与选用的恰当鉴别材料一起使用时，不能在与氧-氢键的光谱区放置高的权重，除非用来鉴别两种材料。使用PLS鉴别时，方法的特性会得到提高，因为两种光谱或化学性能相似的材料的光谱差异已经降到最低，将这些材料划分成目标材料的可能性（假阳性错误）也降低了。■　标准样品选择，允差极限定义与验证建立PLS ID标准模型至少需要5个标准的目标材料样品和3个鉴别材料样品。优化的标准集应该包含不同供应商、不同批次等的样品，以确保稳固性。所必须的第二种目标材料样品，其中包括相同的变化，但是不包含在标准模型内。第二种目标材料（允差确定）的目的是计算要制定验收通过/失败极限。因此，称最后的标准模型以及相应的验收标准为原材料鉴别器（RMD）第三种样品，也就是最后一种样品（验证集）应该由大量的目标和非目标样品光谱组成。此检测提供RMD特性验证，作为唯一的目标样品应该通过规定的验收标准，而所有的非目标样品则不能通过。在将样品归入这三类的任一类前，必须使用各自的简单ID法对它们进行分析以确保其同一性。■　 模型的建立第一步，选择某类的标准光谱，并设置预处理选项，这些预处理选项通常与任一给定的鉴别模型相同。使用PLS算法并通过化学计量学程序包对模型进行计算。 使用不同的图标很容易看出鉴别质量。 对于每个可能用到的鉴别标准（范围，得分与光谱残值），可以计算允差极限值的标准偏差（s）。每种情况的验收标准通常设置为绕均值上下波动为±3s的极小值。这样可确保至少99%样品将符合验收标准并保持产生假阳性的概率最低。■　原始模型验证因为所有的光谱都会根据库内的RMD检测，所以，系统会自动对样品进行交叉检测。如果一个良好的目标材料验证标本不能产生阳性结果，那么这个标本应该放到标准或公差集中重新计算。 如果某个非目标标本被认定为目标标本（假阳性错误），其原因可能是选择了错误的鉴别材料或验收标准设置不正确。不能对模型或验收标准重新计算，但是可将没有修改的模型或验收标准设置成其它的RMD。同时必须对正在处理的RMD重新验证。并将程序存档以符合管理机构的要求。对于训练有素的模型开发者而言，根据鉴别的难易程度，验证30种产品的分析仪大约需要3～4周。图3显示了建立和执行模型的步骤。

一旦很好地完成了原始RMD的开发和确认，就将分析仪放置到正常的操作环境中去（卸货码头或实验室）。推荐用标准ID分析技术对日常进货的原材料进行NIR分析以证明其等效性。为了积累大量有用的数据，根据不同原材料的进货频率，本操作需持续1~3个月。验证协议的状态应该反映正常的分析状态（不同的操作者，不同的供货商等），该工作一旦完成，便可正式使用仪器了。仪器的零点无需校准，因为ABB的FT-NIR仪器的频率重复性(0.002cm-1)、精度(0.04cm-1)以及强度的再现性（0.002 A）性能非常卓越。当添加新的供货商或向数据库添加新的材料时，需要对模型进行维护（如果原始模型与鉴别设置不能识别好的样品）。然而，由于模型是为每种材料独立开发的，所以没有必要为给定族的材料重新计算和重新验证，否则在验证过程中会发现产品的重叠。当添加或修改某个产品而需重新对方法进行验证时，ABB的方法可以降低验证所需的时间和成本。在执行原材料鉴别NIR分析仪时，模型的开发和验证所需的投资最大。因此，在仪器使用期间或仪器维护后，模型的可转移性就变得非常重要。ABB可以保证具有相同取样辅助检测套件的FTLA2000光谱仪良好的可转移性。

执行实例以盐酸伪麻黄碱与硫酸伪麻黄碱为例说明NIR是如何进行鉴别的。

图4显示了NIR区域中两种产品的典型原谱。用于鉴别的两因素-PLS模型预测值图形（图6）显示了两种伪麻黄碱构成的典型区别。也可用残留物图形（图7）来区分其他所有的化学光谱与麻黄碱。代表了大约300种不同的原材料的残值图形的670种光谱同样清晰地显示了伪麻黄碱与其他化学品之间的明显区别。其他的结果如分值图形也可用来鉴别不同的材料。另外，基于覆盖了99.99%、从上面取得的总体分布验收标准的统计学计算可以得出盐酸伪麻黄碱产生假阳性鉴别的概率以指数函数的形式降低到0.00003% （大于5倍标准偏差的距离）盐酸伪麻黄碱对硫酸伪麻黄碱的PLS标准确保了产生假阳性错误的最小概率，该错误就是把不是盐酸伪麻黄碱原料鉴别成盐酸伪麻黄碱。 如此高的性能（产生假阳性的概率）说明了用NIR ID方法替换整个简明ID检测方法的合理性。

总结

使用NIR分析仪鉴别原材料可以极大地降低分析周期，从而降低了分析的库存，缩短了生产周期。ABB的FT-NIR仪器具有很多优点：分析仪表现出很高的固有的稳定性，消除了模型维护的麻烦；可在非接触式模型中进行测量，这样可以消除交叉污染；用PLS算法建立的模型可以把产生假阳性鉴别的概率降到最低，并且可以建立起易执行，验证与更新的独立模型；保证了仪器间模型的可转移性，并无需对仪器进行维护。