探秘水体中的类固醇激素

激素在自然界中的重要性不言而喻，它会对某一物种的整个机体产生影响。从生长的调控乃至机体组织的再生功能皆受到类固醇激素的影响和作用。合成的类固醇激素能对人类和动物的生长发育或繁衍后代发生影响。研究证明，水体中一些高浓度激素性活性物质会导致某些雄性鱼类发生雌性化变异现象。

欧洲2000/60/EG规范及其补充和修正，对水体保护实施了严格的质量管控。在其优先级、关注级和严重危险级的物质中，列入了天然以及合成类固醇激素，如17-α-炔雌醇、17-β-雌醇等，并针对其监测提出了低水平限的年平均环境质量规范要求。对于内陆水域而言，该水平限为0.035ng/L（17-α-炔雌醇）及0.4ng/L（17-β-雌醇）。注意检测限只允许为各UQN规定值的30%，执行该措施的前提是存在一种合适的仪器或技术，能够快速可靠地对低浓度的激素物质定性和定量。在分析中采用和建立的分析方法往往达不到所要求的灵敏度，因此迫切需要开发一种新方法。

图1. 在线固相萃取运行方式图解（a；进样；b：萃取；c：淋洗；d：在线富集）。

选择合适的技术

为测定具激素作用的物质，在分析中应用了气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。以GC法测定激素时，多数情况下需要采取附加的衍生化步骤，以便使分析溶质的极性适合于所用的气相色谱柱。但繁杂的步骤往往对方法的重现性和可靠性产生不良影响。对GC而言，低至亚毫克的检测限通常只能借助于大体积的进样（如1000ml）实现，要求对目标组分强力浓缩。为将浓缩系数从1:1000提高到1:5000，一般要采用液-液萃取（LLE)或在线固相萃取（SPE），但这些方法非常耗时且成本高。

本文在HPLC基础之上开发出一种稳定、快速的高自动化的方法。在HPLC-MS/MS联用技术方面采用直接进样积累的经验，为进一步开发适用于饮水、地下水和地表水中激素类物质的测定提供了基础。为了达到尽可能低的检测限，研究人员还开发了在线富集方法。

直接进样法

选择6种激素以HPLC-MS/MS联用方法进行加工，其色谱和光谱法的运行条件于沃特世Acquity UPLC xevo TQ-S超高效液相色谱仪上进行优化，进样量根据所加体积予以优化。实验表明，大体积进样直至250μl并无问题，而进一步提高至1000μl并不能提供更多优点。由于放弃了对分析溶质预富集浓缩步骤，因此可直接进样无需样品前处理。对含有悬浮物质的样品则事先将水样通过玻璃棉滤器加以过滤。可采用注射器前置滤头直接于制备自动进样器之前做好。在有效实验范围2~100ng/L浓度内，获得了良好的线性和方法重现性的结果。采用加入具有不同基体的水的标准加入法试验，表明方法能够适应于地表水的研究。对于所有检测的物质而言，检测限始终介于5~10ng/L。

在线富集法

为了改进检测限，研究人员基于直接进样法的结果开发了一种在线富集技术。应用沃特世两种相互独立的泵系统以及多组6通转换阀（见图1d)，借助于附加的泵系统进行在线富集，而二元泵则进行淋洗和色谱分离。方法步骤均实现全自动，从而获得了较高的重现性。为进行在线固相萃取，需要附加的转换阀，以便对固相萃取富集柱予以条件化，将分析溶质从样品中予以富集并将其以反向液流的方式冲洗到色谱分离柱上。在方法确证的范围内对重要影响因素进行了优化。例如适当的固相萃取柱的选择关乎到样品的富集和色谱分离柱。此外，还优化了进样体积以及进行装载和淋洗的流速。

图2. 在线固相萃取富集法的色谱图（TIC）（c=100ng/L，富集体积5ml）。

阀路转换系统

将必要的阀路转换系统显示于示意图中（见图1a、1d)，并作以下描述：

进样：将5ml样品环以事先过滤的水样充满，借助于附加泵系统（QSM)对固相萃取富集柱进行条件化；

萃取：启动阀1（V1)借助于附加泵QSM将样品通过固相萃取富集柱进行富集，流速为2ml/min，组分的萃取于2.5min结束；

淋洗：此时启动阀2（V2)， 用二元泵以反流模式从固相富集柱上将所萃取富集的物质冲洗到色谱柱上，借助淋洗液流将物质送到色谱柱上进行分离并以质谱检测器检测，用色谱法所用的洗脱混合液进行淋洗。

图2为所研究的6种激素总离子色谱图。结果表明，对于6种激素均能够进行灵敏、重现性较好的分析。相对于负载较少的水体所研究的地表水基体对富集柱的使用寿命并无明显不利影响。

小结

直接进样法或在线固相萃取法，均适用于合成和天然激素的HPLA-MS/MS测定。方法的有效性确证均系通过标准加入法加入饮水、地下水和地表水的方式进行，并确立了方法的稳定性。

在线固相萃取富集法

在线固相萃取法能够使样品萃取与HPLC-MS/MS联合，以提供重现性和灵敏度良好的结果。完全的自动化提高了样品测定的流通量并提高了工作效率。由于条件化和淋洗等所有工作步骤均为自动运行，提升了分析的效率，并减少了溶剂的消耗，摒弃一次性材料从而降低了运行成本。方法仅需要数毫升样品，因此能进一步节约和简化取样、运输、样品贮存以及样品冷藏等步骤。