潜能无限的膜过滤技术--多样性样品的高效过滤技术

分析前的样品制备步骤旨在让样品与分析方法相匹配，借此达到降低样品的复杂性，清除样品中的干扰性污染成分并且提升分析溶质浓度的目的。典型的高效液相色谱（HPLC）或超高效液相色谱（UHPLC）要求样品必须不含颗粒物且完全能够溶于与系统相适宜的溶剂中。

进行色谱分析前，通常采用针头式过滤器对样品过滤。通过一系列的手动操作过程，逐一将样品过滤。由于涉及样品的类型不同，应用针头式过滤器进行过滤可能相当耗时。对于一些难过滤的样品（如富含颗粒物或高粘度的样品），操作时则要求使用更大的压力，从而给操作人员带来更大的工作量。若要同时完成大量样品的过滤，则会导致实验员产生肌肉酸痛以及重复性过度劳累损伤（RSI）。

默克密理博公司推出的多通道抽滤系统，能让过滤操作变得简单易行，系统通过真空过滤方式可将多达8个样品直接过滤到HPLC样品瓶中（2×32mm），避免了采用针头式过滤器时进行的多次样品转移，在简化了工作流程的同时，也减少人工操作步骤和工作时间。

图1. 多通道抽滤系统简化了样品前处理方法，借助于真空过滤能将多达8个样品直接过滤到HPLC样品瓶之中。

方法与实验

下述实验中，采用具疏水性聚四氟乙烯（PTFE）滤膜和10ml的Millex针头式过滤器，以及疏水性Millex多通道抽滤系统器（孔径0.20μm或0.45μm）进行样品过滤。

测定死体积和样品回收率

将HPLC样品瓶和Millex多通道抽滤系统器（具0.20μm或0.45μm孔径）在分析天平上称重，应用4个多通道抽滤系统进行过滤。将超纯水（2ml）加入所有滤器中，启动真空抽滤，直至过滤完成，再对所有样品瓶称重。用实验室专用布擦拭每个瓶子的底部后，再次对滤器称重。

测定溶质回收率

将4种药片（雷尼替丁、氯雷他定、布洛芬和扑热息痛）分别置于适当体积的溶剂中（900ml）中，并于室温下不断地搅拌直至溶解（24h）。用移液器各取1.5ml药品悬浮液于1.5ml反应容器中，高速离心分离。离心清亮的样品溶液采用UV分光光度计进行测定，将其消光值进行图示。假设这些样品的回收率为100%，并将其通过0.20μm或0.45μm孔径的滤膜过滤器进行过滤。用分光光度计测定滤液，然后将其分析浓度和百分回收率和应用离心方法的结果进行比对。

可萃取物的HPLC UV分析

将3种溶剂（水、LC-MS级甲醇和LC-MS级乙腈）分别通过0.20μm或0.45μm孔径的滤膜过滤器过滤：分别于每一种滤器加入1ml该溶剂，并收集滤液于样品瓶中。再用新的样品瓶取代，继而分别加入1ml溶剂，将滤液过滤到第2个样品瓶中。借助于反相HPLC色谱，以梯度淋洗的方式将样品及流出的溶剂（0~100%乙腈）进行分离，再应用UV检测器（214nm和254nm）进行分析。

图2. 通过Millex多通道抽滤系统进行过滤的溶剂（HPLC：样本）含有较少的可萃取物质，对比于空白样品（HPLC：空白）。既非乙腈（左）亦非水（右）从0.45μm孔径滤膜（上）和0.2μm孔径滤膜（下）萃取出明显的污染成分。

分析颗粒物阻留率

聚苯乙烯胶乳颗粒（0.5μm或0.3μm）于TritonX?100悬浮液中稀释至0.005%，并于227nm处测定吸光度。

各取1.5ml的颗粒物悬浮液置于孔径为0.20μm或0.45μm的滤膜过滤器上，以真空抽滤方式进行过滤。以UV分光光度法于272nm处测定每种滤液（以及TritonX?100的空白样品）的吸光度，并计算残渣的阻留率。

挥发性滤液中样品的回收

将1ml各该溶剂（乙腈、四氢呋喃和丙酮）过滤到事先称好重量的样品瓶中（用0.45nm滤膜）。过滤后立即对样品瓶称重（时间点为0点），再放回至原抽滤系统中，经过10min真空抽滤之后（时间点为第10点）重新称重。通过起始的溶剂重量计算回收率。滤器的死体积介于70~100μl之间。由此可得出损失在7%~10%之间。

实验结果

滤器的死体积可能影响到滤液中样品体积的回收。实验表明，Millex多通道抽滤系统的平均死体积小于70μl。

对于大多数溶液体积为1~2ml的过滤来说，由死体积而导致的样品损失并不明显（见表1）。随后测定了模拟药物开发中样品处理时4种不同分析溶质的回收率（按重量计）。对4种被检测的溶质，滤器的回收率可达到96%~100%（见表2）。

由于该过滤系统可允许多个样品同时进行预处理，因此十分省时。此外系统具有工效学的优点，可以将操作步骤以流水线工作方式进行，无需重复。应用该系统过滤4个样品仅需7步完成，而采用针头式过滤器则需要24步操作。

特别需要注意的是，样品前处理中不得引入其他污染性杂质，对敏感的下游分析更是如此。分析结果可能由来自滤器、滤器外壳或过滤过程中的可萃取性杂质进入样品而致失真。由于过滤的液体与过滤系统间的化学相容性，因此降低可萃取物在滤液中的含量至关重要。为此采用不同的溶剂（乙腈和水，见表2）对其从Millex多通道抽滤系统中萃取出污染物进行检验。由于该系统的滤膜由具化学相容性的疏水性PTFE组成，因此对这两种溶剂而言杂质的释放甚微（见表1）。以UV分光光度法于214nm处分析萃取物。通常进行消光测量时所用的波长越短，则可萃取性污染愈易辨识。

衡量膜过滤效率的标尺是，滤膜能够阻止粒度大于其孔径的颗粒物通过。因此分别用直径为0.5μm和0.3μm的颗粒物对0.45μm和0.2μm孔径滤器进行实验，几乎所有的颗粒物均被滤膜阻留。其中0.2μm孔径滤器的保留率为95%，0.45μm孔径滤器为100%。

分析方法要求分析溶质的浓度在样品过滤的过程中保持稳定，特别要避免溶剂挥发的情况发生。为检验挥发性溶剂在过滤后的回收率，应分别在溶剂过滤后（0时间点）和真空抽滤10min后（第10时间点）立即称重。对于3种测试的溶剂而言，在经过较长时间的真空抽滤后，回收率均未发现显著的改变。

自动化过滤系统

通过多通道抽滤系统对样品前处理中高效过滤的合理改进，从而提高了生产效率，优化了液相色谱的分析数据。该过滤系统借助于有效的颗粒物阻留、较少的可萃取物污染，因此对于敏感的下游分析以及敏感的质谱分析法的分离而言，是一种合适的样品预处理方法。高分析溶质回收率、较小的死体积以及对于挥发性溶剂良好的回收率，有助于节约样品材料、时间和成本。