2D-LC助力中药质量控制

近年来通过提升色谱柱效，进而提升分离能力的技术得到蓬勃发展。以亚二微米填料技术为基础的超高效液相色谱技术，及高温多柱串联技术皆使液相色谱的分离度提升到更高的水平。超临界液相色谱技术的复兴与质谱技术的发展，则是从选择性的层面为分离度的改善提供了另一实用的技术或工具。其中质谱的选择性离子监测技术大大拓展了分离纬度。但离子抑制现象的存在影响了对不同浓度物质检测结果的灵敏度和准确性，尤其对于低浓度组分而言，与采用5μm经典色谱柱的高效液相色谱相比，上述采用单一液相色谱模式（1D-LC）进行的分离，虽提升了分离能力，但时间较长，若要实现一维（1D）液相色谱的最高峰容量（1400~1600之间），分离时间需长达几个小时。复杂混合物的分离需要更高的分离能力，通常需要梯度色谱实现分离，其分离能力最好使用色谱峰容量来衡量。简单而言，峰容量是衡量指定时间内，使用指定色谱柱，能以一定的分离度分开均匀分布的色谱峰个数。峰容量数值越大，分离能力越强，可分开更多的色谱峰。根据理论计算，峰容量数值要约大于色谱峰数量100倍，才可能基本分离在色谱图上随机分布的色谱峰。1D-LC在适当分离时间内，有限的分离能力及对复杂体系分离分析的需求，使二维液相色谱技术应运而生，近年来日益受到关注。

2D-LC技术的特色及优势

2D-LC技术是样品经过两个不同分离机理或过程的液相色谱分离，通常通过柱切换技术来完成，其最大优势是能提高峰容量。理论上2D-LC的峰容量是1D与二维（2D）色谱分离峰容量的乘积，远高于1D-LC获得的峰容量。实际分离过程中峰容量的结果会受限于2D-LC的正交性程度及分离过程中两维分离的实际效率。但优化的2D-LC方法通过两个不同分离过程或机理对相同样品的分离，可降低色谱峰的重叠，显著改善分离结果。此外，由于一个组分可获得两个保留时间（1D和2D），可增加色谱峰确认的可靠性。
2D-LC可分成离线与在线两种类型。离线2D-LC是将一维色谱柱分离出的馏分，按时间依次收集后浓缩，或直接进样，进行2D分离。与在线2D-LC相比，操作上较简单，峰容量较高，可免除1D与2D的色谱兼容性问题；但离线模式分析时间长，难于自动化，重现性较差，若样品组分不稳定，会在2D-LC分离前发生变化。在线2D-LC不仅能在短时间内获得高峰容量，且自动化程度高，是目前复杂体系分离手段中发展最快和最受关注的技术。

在线2D-LC又分为中心切割和全二维两种方式，1D与2D两只色谱柱通过阀或接口相连。二者的区别在于1D色谱柱出来的组分转移到2D色谱柱的量。对中心切割方式而言，从1D洗脱出来的馏分，只有含有目标馏分或组分的部分被转移到2D色谱柱上继续进行分离。常见的在线固相提取也可为2D-LC中心切割的一种方式。该分离方式的主要特点是：第一个色谱柱中洗脱出来的组分仅部分进入第二维色谱柱；通常色谱峰会被整个切出，第二维采用较长的色谱柱，故梯度可比全二维长；损失部分样品信息，但目标色谱峰的数据质量更好。

在线2D-LC进样方式中所有从1D色谱柱流出的组分都被转移进入2D色谱柱进行分离。两个色谱柱通过接口相连，确保将第一维色谱柱流出的所有组分自动切入第二维色谱柱中进行分离。在后续馏分被切入第二维色谱柱之前，前一个馏分已成在二维色谱柱上分离。第二维的分析时间应该是少于或等于阀的切换周期。通常1D色谱柱30min的一次进样分离，可有近百个来自1D色谱柱的馏分切入2D色谱柱，相当于对2D色谱柱的近百次进样与分离。在线2D-LC分析的运行时间即是1D分离的时间，可在较短时间内实现较高峰容量。在线2D-LC过程的主要特点是：1D色谱柱中洗脱出来的组分全部依次进入2D色谱柱；1D色谱柱一个色谱峰通常会被切成3~4个馏分，分别进入超快梯度分离的2D色谱柱中进行分离；分离过程中保持1D色谱柱所获得的分离度；第二维色谱方法的运行时间与第一维洗脱馏分的收集时间需匹配；色谱峰在数据分析时需软件重新构建。

典型的全2D-LC系统组成包括：2个色谱泵、2个色谱柱、1个进样器、1个接口或调制器（包括阀、定量环或富集色谱柱），以及一个检测器。工作站软件的设计对全二维2D-LC系统也非常重要，因为通常一次1D进样，甚至需要上百次的2D梯度分离，若手动设置这些梯度表，不仅耗时，且容易出错。新型商品化2D软件的发展，不仅可以简化和缩短实验设置过程，而且可以简单根据1D分离梯度变化灵活设置2D分离的不同梯度，以实现更好的分离效果元。全2D-LC的3D数据分析需要专门的软件进行定性与定量。

在线全2D-LC的分离质量与方法的设计、液相色谱系统的硬件优化以及数据系统的控制与数据分析能力直接相关。按照2D-LC方法设计，两维分离模式组合的选择对方法的正交性影响最大，会直接影响到峰容量的大小。因此，两维色谱柱的选择不仅要考虑到填料分离模式的选择性差异。此外，还需要关注两维分离中所用溶剂的兼容性和具体的操作条件优化。RP（反相色谱）、NP（正相色谱）、SCX（阳离子交换色谱）、SEC（体积排阻色谱）及HILIC（亲水相互作用色谱）皆可用于2D-LC的两维色谱组合，其中SCX-RP、HILIC-RP以及RP-RP/2D-LC的正交性最为理想。上述组合在蛋白组学、食品分析、植物提取物分析、生物制药分析及聚合物等复杂体系分析中皆有应用元。2D分离甚至可使用平行的多个色谱柱以进一步提高峰容量。

1D和2D色谱柱之间的接口设计也至关重要，是全二维2D-LC硬件技术的核心。良好的接口设计可以确保完全对称的流路，尽可能降低或避免两维溶剂的相互影响，降低分离过程中的色谱峰扩散。接口的突破性技术会大大提升全2D-LC的方便性与实用性，使得这项技术更加简单易用。此外，2D-LC系统的硬件优化需考虑对小规格色谱柱的兼容性，2D的快速梯度分离能力，以及色谱检测器的高灵敏度检测能力。

在线2D-LC在中药质控的应用

在线全2D-LC可在短时间内实现高峰容量，适于复杂的中药体系分离，成为中药质量控制的有力工具。中心切割法可在线有效地去除干扰组分，适用于中药复杂体系目标组分的定量分析。使用在线SPE-HPLC法分析复方甘草制剂中的吗啡是中心切割法2D-LC在中药质量控制方法中的应用实例。该方法在1D与2D色谱柱间使用了富集小柱，通过软件自动控制阀切换，实现了样品净化、富集与分析的全自动过程，以高重现性实现目标组分吗啡的定量分析。与离线SPE过程相比，方法分析速度快，分离效果良好，操作简便，使用成本低。

根据中药复杂物质组成的特性，使得2D-LC，尤其是在线2D-LC技术有更加广泛的发展空间。一方面该技术较强的分离能力可用于建立不同品种和相同化学组分定量分析的质量控制通用方法的技术平台，同时实现中药品种目标化学成分定量与指纹图定性；另一方面可在提高中药质量标准中发挥其信息丰富，分离能力强等技术优势。2D-LC与质谱联用时，单一色谱峰可获得丰富的数据信息、如色谱峰的1D和2D保留时间信息，色谱峰光谱信息和质谱信息。这些信息大大增加数据的置信度，提高中药组分定量与定性的可靠性。此外，2D-LC的多维信息具有更强的指纹特性，可用于中药组分的质控与溯源分析。

图4是某中药注射液的在线全2D-LC分析元，可看出在第一维保留时间（横坐标）相同的色谱峰可以在第二维（纵坐标）上完全分离。该方法还使用飞行时间质谱检测器（TOF）与全2D-LC系统相连，因此直接获得了相应组分的准确分子量信息，并利用谱库直接检索，推断和确认了色谱峰的化学结构。在线2D-LC可去除1D分离中非挥发性的，质谱不兼容的缓冲盐流动相，在不改变原始色谱条件下，即保持1D分离选择性的前提下，选择性地中心切割目标组分进行质谱分析元。

小结

在线2D-LC技术能在适当的分析时间内大幅提高色谱峰容量和分离能力，在中药复杂体系质控中的应用前景广阔，其中心切割模式能有效去除复杂体系的干扰物质，是简化样品前处理，实现复杂中药体系自动化和高通量定量分析的有效途径。整合2D-LC硬件和软件的商品化全2D-LC系统的出现，为高通量自动化分析创造了有利条件。