高效测定红参的活性成分

红参的主要活性成分包括人参皂苷Rg1、Re和Rb1，常规分析主要用HPLC-UV法、HPLC-ELSD法，多使用250mm×4.6mm×5μm或150mm×4.6mm×5μm色谱柱。本文采用Rigol Compass C18 、Rigol Compass C18(2) (及Agilent Poroshell 120 EC C18 三种色谱柱对红参进行分离。

实验方法

仪器与试药

RIGOL L-3000液相色谱仪，电子天平，超声波清洗仪。人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rb1，红参，乙腈，甲醇，超纯水，正丁醇，三氯甲烷。

对照品及供试品溶液制备

精密称取10.1mg人参皂苷Rg1、9.9mg人参皂苷Re、10.3mg人参皂苷Rb1至10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容。取红参粉末1.001g，置索氏提取器中，加三氯甲烷100ml，加热回流3h，药渣挥干溶剂，移入锥形瓶中，精密量取水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取30min滤过，弃初滤液，精密量取续滤液25ml蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，用0.22μm滤膜过滤。

结果与讨论

常规色谱柱测试结果

采用常规色谱柱分析条件的方法1、2对红参样品进行测试分析（色谱图见图1、测试结果见表3），通过人参皂苷Rg1、Re和Rb1对照品溶液，确定1#为人参皂苷Rg1，2#为人参皂苷Re，3#为人参皂苷Rb1。结果显示：理论塔板数以人参皂苷Rg1峰计，均大于9000，人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度均大于2.2。

采用Rigol Compass C18、Rigol Compass C18（2）色谱柱进行红参中人参皂苷的分离，可达到中国药典的要求。

快速色谱柱测试结果

新型的表面多孔颗粒高效液相色谱柱能在高效液相色谱的压力范围内实现高效率、高分离度的快速分析。本文中使用的Poroshell 120色谱柱由2.7μm颗粒填充，可实现相当于亚2μm颗粒填充色谱柱80%~90%的性能，反压却低将近50%。

根据公式1计算从150mm×4.6mm×5μm常规色谱柱转换成100mm×4.6mm×2.7μm色谱柱后的梯度洗脱时间。根据方法3进行红参中的人参皂苷Rg1、Re和Rb1分离（色谱图见图2、测试结果见表4），人参皂苷Rg1、Re的分离度达2.679，理论塔板数以人参皂苷Rg1峰计为14385，系统压力最大值为207bar，分析时间可由原来的100min减少至67min。

公式1，其中：Timecol.i：梯度洗脱时间（i=1、2）；Volumecol.i：色谱柱柱体积（i=1、2）Poroshell 120色谱柱因为具有极小的粒径分布和扩散路径，减小了轴向和纵向扩散，大大提高了柱效。该色谱柱具有更高的分离效率，在更高流速条件下，仍保持分离性能。故提高流速至2ml/min，根据公式2算出理论梯度洗脱时间。根据该方法进行红参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的分离（色谱图见图2、测试结果见表4）。人参皂苷Rg1、Re的分离度达到2.501，理论塔板数以人参皂苷Rg1峰计为11192，此时系统压力最大值达到449bar，分析时间由原来的67min减至34min。

公式2，其中：Timecol.i：梯度洗脱时间（i=1、2）；Flowcol.i：流速（i=1、2）

色谱柱的选择

本实验选择了3种色谱柱，对于常规色谱柱Rigol Compass C18 (250mm×4.6mm×5μm)和Rigol Compass C18（2）(150mm×4.6mm×5μm)，人参皂苷Rg1和Re的分离度均达到药典要求，方法重复性好，但分析时间过长，在质控、含量测定时消耗了大量时间与资源。选择Agilent Poroshell 120 EC (100mm×4.6mm×2.7μm)色谱柱时，方法重复性高，分离度好，分析时间减少至67min，反压仅为207bar，适用于大部分HPLC。Poroshell色谱柱在高流速下仍保持较高的分离效率，故调高流速至2ml/min，相应转换梯度分离条件。提高流速后，人参皂苷Rg1和Re的分离度达到2.501，分析时间仅为34min。

色谱条件的优化

本实验在测试过程中发现系统反压随着进样次数的增加而逐渐增加。进行红参重复性测试后，人参皂苷Rg1、Re、Rb1的定性重复性分别为0.29%、0.15%、0.03%；定量重复性分别为0.33%、0.37%、0.28%。因红参样品基质复杂，而药典中给定方法有机相组成最高时为40%，随着进样次数的增加，有些杂质不能完全从色谱柱中洗脱，造成了反压逐渐增大的现象。当在原有方法基础上添加高有机相（90%B）洗脱10min后测试，人参皂苷Rg1、Re、Rb1的定性重复性分别为0.11%、0.06%、0.05%；定量重复性分别为0.19%、0.17%、0.16%。优化过的色谱条件一方面提高了谱图重复性，另一方面提高了色谱柱的耐用性。

小结

采用3种色谱柱进行红参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的分离均可达到药典要求，且梯度时间由100min减至34min，大大提高了效率并节省了溶剂，为红参的质控提供了一定依据。