快速测定水产品中的PSP残留

麻痹性贝毒(PSP)是一类水溶性的神经毒素，主要来自有毒的涡鞭毛藻及具麻痹性贝毒的细菌，经食物链的网络转换与流动，不可逆地富集在可食性贝类体内，从而影响浮游动物、鱼类、鸟类和海生哺乳动物，并造成毒害。近年来，麻痹性贝毒中毒事件时有发生，我国出口到日本的海产品屡次被检测出麻痹性贝毒严重超标，麻痹性贝毒污染已严重危害我国公众健康和贝类产业的发展。

麻痹性贝毒包括26个能导致神经毒性的天然化合物。其中石房蛤毒素( Saxitoxin，STX) 是PSP中最著名、毒性最强的毒素，其他化合物的毒性，均以STX毒性为基准值。

美国、欧盟规定水产品中PSP的法规限量为：毒性总和不高于STX 800 ppb。2005年，美国FAO、WHO和IOC联合推荐PSP的法规限量为：毒性总和不高于STX 170 ppb（按每人消费250g贝类计算）。随着PSP分析的进一步发展，法规限量的要求会更高。

本文建立了HILIC/ESI/MS/MS快速测定贝类和蟹中10种常见毒素的方法。由于PSP为碱性易溶于稀酸溶液的水溶性化合物，采用亲水作用色谱柱（HILIC）具有很好地保留，并能将PSP的多个同质异形体很好地分离开来。本方法采用外标法，定量下限为20μg/kg，标准曲线范围为20~1000μg/kg。

实验条件

仪器与试剂

Surveyor HPLC液相色谱仪系统，配有Surveyor自动进样器和LC Pump；TSQ Quantum Access三重四极杆串联质谱仪，配有ESI源；标准品C1、C2、GTX2、GTX3、GTX1、GTX4、GTX5、STX、NeoSTX、dcSTX，纯度高于90%；用1mol HCl溶解并配制成0.5mg/ml标准储备液，并置于-20℃冷藏备用。除特殊说明外，所用试剂至少为分析级，乙腈为色谱纯。

样品制备

分别将贝类和蟹的软组织取出，在冰水浴中搅碎、混匀，精密称取5g，置于50ml离心管中，加入4℃含0.1%甲酸的乙腈/水（80：20，v/v）溶液10ml，在冰水浴中10000r/min匀质5min，3500r/min离心15min，上清液倒入50ml离心管中，于-20℃条件下放置4h，提取液分层，弃去上层溶液，取底层溶液3ml。

用PHEA固相萃取柱进行SPE净化。依次用含0.1%甲酸的乙腈/水（10：90，v/v）溶液、含0.1%甲酸的乙腈/水（90：10，v/v）溶液各5ml活化固相萃取柱后，上样，抽干，先用4℃含0.1％甲酸的乙腈/水（80：20，v/v）溶液3ml洗脱，然后再用4℃含0.1％甲酸的乙腈/水（10：90，v/v）溶液1 ml洗脱，收集该1ml洗脱液，过0.45μm滤膜，供LC/MS/MS法测定。

Accela U-HPLC液相色谱条件色谱柱：TSK-Gel Amide-80 column 250×2mm， 5μm (Tosoh Bioscience)；梯度洗脱和流速见表2，其中A：乙腈；B：0.02%甲酸、2mM甲酸铵水溶液；柱温：30℃；进样量：25μl。

TSQ Quantum Access质谱仪条件

电喷雾电离源（ESI），正离子模式；选择反应监控（SRM）扫描模式，喷雾电压：4500V；离子传输管温度：300℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为35arb， 辅助气为5arb，氩气用作碰撞气， 碰撞压力为1.5mTorr； 选择反应监测（SRM）离子对见表3，扫描宽度为0.002， 扫描时间为0.050ms。

结果与讨论

本方法在贝类和蟹类中，C1、C2、GTX2、GTX3、GTX1、GTX4、GTX5、STX、NeoSTX、dcSTX的定量下限为20μg/kg，图1为20μg/kg添加得到的典型LC/MS/MS色谱图。其基本原理为：组织匀浆样品用含0.1%甲酸的乙腈/水溶液提取，并沉淀蛋白，于-20℃条件下冷冻分层，取底部水层，过PHEA固相萃取柱净化，串联质谱（HILIC/ESI/MS/MS）法检测。方法在贝和蟹中测定10种常见PSP毒素的平均提取回收率均应在40%以上，均满足国内外的最低检出限要求，并且定量定性准确，重现性好。

小结

本方法建立了10种常见PSP毒素在贝、蟹等动物组织中的LC/MS/MS检测方法，10种常见毒素在定量下限20μg/kg的毒性相当于103.6μg/kg的STX。方法灵敏度、提取回收率、重现性等均满足国内外监控和检测要求。