最新型显微镜

　　使用了半个多世纪的荧光显微镜能够清晰显示特殊的细胞与组织结构。德国维尔茨堡市的科学家们研发出能够同时标记与拍摄九个甚至更多不同细胞结构的新方法。

图1 利用荧光颜料对9个不同的细胞结构进行标记并利用sFLIM光谱分辨荧光寿命成像显微技术拍摄了照片(A)，利用荧光标记探测点(C)的特性图案可以探测各个样本的结构(B)

　　利用科学家们的新方法可以完成15个甚至更多的标记，做到这一切的前提是荧光信号的精确定位，必须利用光谱分辨荧光寿命成像显微镜sFLIM。

　　荧光显微镜能够检测到什么?

　　荧光显微技术一直是生物技术研究中最常用的成像技术。为了能够拍摄单独细胞或特定组织区域中的特殊结构图片，必须使用荧光颜料染色标记。这些染色的探测点，例如，蛋白质、脂肪或DNA始终保持不变，并可以用荧光显微镜拍摄成图像。对于生物学家来说，利用这一技术可以清楚观测到具有一定现状的细胞骨架、细胞核的壳或新生DNA链的范围。

　　在荧光显微镜中，传统的荧光显微镜大多自动根据荧光强度(颜料的颜色)分别单独完成检测。视荧光显微镜的具体配置形式而定，它可以完成单色或多色检测实验任务，从而可以得到一定数量的、显示细胞结构或组织切片结构的图片。

　　维尔茨堡生物技术研究所的Sauer教授的博士研究生Thomas Niehörster先生表示，“最困难的是将许多非常相似但又具有不同荧光染色点区分开来。”可用荧光颜料的颜色数量有限，同时受到荧光显微镜复杂性及成本费用因素影响，荧光显微技术的另一个特性使得FLIM荧光寿命成像显微镜得到广泛应用。在此种荧光显微检测技术中，荧光材料发射光谱(颜色)不再具有决定性的意义及作用。相反，荧光材料发射荧光光谱的寿命——持续时间起到了决定性作用。经常与维尔茨堡研究所开展项目合作的Picoquant公司便是一家专门从事FLIM时间分辨方法检测仪器设备研发及生产的企业。

　　荧光光谱及颜料寿命

　　为了尽可能多的将分子做好标记并区分开来，科学家们在他们发明新方法的过程中将荧光光谱及荧光寿命检测结合到一起。该种方法被称为光谱分辨荧光寿命成像显微技术，缩写为sHLIM，将两种检测技术的优点结合到一起。同时，克服了两种常规系统在检测速度、检测灵敏度及分辨率等方面的缺点。在激发荧光标记探测点时，科学家们使用了三种不同波长的脉冲激光(蓝、绿、红)。除检测荧光光谱的差异之外，科学家们也同样利用专业的探测器探测荧光颜料的寿命，荧光颜料寿命范围仅为几纳秒。

图2 用同一种荧光颜料(ATTO 488)在三种不同的探测样本(毒伞素、叠氧化物和壳体)上做好了染色标记，从而能够显示三种不同的分子结构：毒伞素分子链(绿色)，细胞核的DNA(蓝色)和所谓的高尔基体(绛红色)。高灵敏度的sFLIM光谱分辨荧光寿命成像显微技术就能得到这样的检测分析结果

　　Niehörster先生表示，“每一种荧光颜料均具有特定图案，表示出一定特性的花纹样式，能够清楚表明与其他荧光颜料的不同之处。”利用每一束激光，科学家们能够区分出五种不同的荧光探测点，理论上可以同时区分15种不同目标。最终，该种技术的限制性因素并不是可以选用的颜料，而是生物探测点的可用性。在该种情况下，一副荧光图片可以成功利用9种颜色表示出不同的分子结构(参见图1)。

　　为了能够分析相对较复杂的检测数据，维尔茨堡的科学家们与哥廷根大学的Enderlein教授领导的软件设计开发工作组进行了合作。合作成果显而易见：新方法十分可靠。

　　据Sauer教授介绍：“探测点的归类达到了前所未有的精度。”该归类方法能够利用sFLIM方法探测出最小差异。给人们留下最深刻的影响便是探测点染色：仅用一种颜料就能够区分出分子的三种不同结构。如果该种方法仅用于为三种不同探测点染色，所得出的差异、区别足以通过三种图案确认，从而能够拍摄出十分清晰的细胞结构图像(参见图2)。

　　分子医学领域中新的可能性

　　sFLIM光谱分辨荧光寿命成像显微技术为分子医学领域开辟了新的道路。通过将被测样本多重标记可以同时对多个靶分子进行观察与分析。将来，该种方法不仅可以在医疗诊断中使用(例如，组织活检评估)，也可以在生化细胞分析中扮演重要角色。

　　该种方法较高的灵敏度也能够在将来轻松的完成由背景信号触发的检测分析任务。尤其是具有自体荧光的组织样本，常常为荧光检测技术带来麻烦：低浓度的靶分子难以探测，将导致假阳性信号。将来，sFLIM光谱分辨荧光寿命成像显微技术的图案分析能够以较高的精度、最小的信号损失将真实信息从背景中分离出来。

图3 sFLIM光谱分辨荧光寿命成像显微技术与STED受激发射损耗显微技术的完美结合

　　此新型技术方法能够较好与高分辨率的STED受激发射损耗显微技术结合起来使用。德国物理学家Stefan Hell先生因STED受激发射损耗显微技术荣获了2014年度的诺贝尔化学奖。Picoquint公司的物理学家们成功在STED设备上展示了新方法，提供了最佳荧光信号分离可能性(参见图3)，使得将来有可能轻松利用高分辨率显微镜同时分析不同的物质结构。

　　商业及科学界的研发成果

　　sFLIM光谱分辨荧光寿命成像显微技术是维尔茨堡大学生物技术与生物物理学研究所、哥廷根大学(软件)和柏林的Picoquant公司(硬件)的成功杰作。合作成果已发表于专业杂志《自然—方法学》。该项目同时得到了德国联邦教育与研究部(BMBF)的帮助及支持。

来源：实验与分析