全面提升HPLC洗脱技术质量

　　超高效液相色谱洗脱技术的质量取决于什么?如何利用QbD评判色谱仪洗脱质量，它除关注关键性的邻近双峰外也考虑了洗脱的稳定性。

图1 色谱洗脱技术的经验模型。模型中的影响因素有梯度时间(tG)、温度(T)、有机洗脱剂B的初始浓度(%Bs)及最终浓度(%Be)、水质洗脱液A的酸碱度pH值以及流率(F)，还有目标值、多峰值的分辨率以及最短的分析时间等

　　液相色谱洗脱技术质量的好坏与许多因素及目标值相关。在医药产品的小分子检测分析过程中，根据小分子的实际情况影响UHPLC超高效液相色谱分析质量的因素最多可达十项，而且它们之间的相互作用及相互影响十分明显。这些因素都可以在梯度时间(t_G)、温度(T)、三元洗脱液组合物(t_C)、有机洗脱剂(B)的初始浓度(%Bs)和最终浓度(%Be)、水质洗脱液A的酸碱度pH值以及流率(F)中被找到。当然，洗脱柱的固定相也是一项十分重要的影响因素。这里的目标值被视为是UHPLC超高效液相色谱洗脱过程优化时的关键分辨率Rskrist(色谱图中最差的双峰分辨率)以及检测分析时间最小化时色谱图中最后一个峰值的保留时间tRmax。常规的分析时间最小化方法具有明显提高检测分析流量及提高UHPLC超高效液相色谱分析实验室生产能力的潜力。

　　市场中销售的计算机辅助超高效液相色谱分析方法开发软件(CMD)，例如，Dry lab(莫尔纳—色谱应用技术研究所)及Chromsword(VWR国际公司)最多具有对三个因子进行优化、只允许有一个目标值(关键双峰分辨率)的限制。绕过了其“全面优化”方法，没有一项诊断分析或只允许有一个策略来识别及改善存在的问题。

　　当UHPLC超高效液相色谱洗脱筛选的工艺参数大于三个以及目标值大于一个时，则可以利用非常高效的计算机辅助超高效液相色谱洗脱优化软件(色谱技术建模软件，例如，Dry lab 4)和统计试验设计(统计试验设计软件，例如，Modde 11 Pro)来实现。

　　试验

　　试验由Robert Kormany先生(Egis制药公司)、Imre Molnar先生及H.-J. Rieger先生(Molnar研究所)负责完成，试验参数为：

　　色谱柱：规格为50×2.1 mm的UHPLC色谱柱，填料粒度2微米。

　　洗脱液：流动相是乙腈及5 mm磷酸二氢铵—缓冲液混合而成的混合液。样本中含有10μg/mL的氨氯地平及欧洲药典中的污染物(A、B、D、E、F、G和H类)，溶液中乙腈及水的比例为30:70(容积比)。

　　九项不同的UHPLC色谱柱，每一项均做出四次色谱洗脱(线性梯度30%B～90%B不等，梯度时间3分钟及9分钟，温度15摄氏度及45摄氏度)，含有磷酸盐的缓冲剂A具有三项不同的酸碱度pH值(2.0/2.5/3.0)，试验设备型号为Shinadazu LC 2010C(滞留容积1.06毫升)，探测波长为254纳米，注射量为1μL。

　　建立在经验基础之上的过程模型

　　从(由Molnar色谱技术研究所提供)3因子优化原始数据可以推导及建立起UHPLC超高效液相色谱分析过程。同时，优化时所需的所有工艺参数均适用于3个色谱柱、具有六项参数及多目标的分析过程经验模型(参见图1)，并能使该模型可视化。为实现最稳健的筛选，该实验应用高效的统计试验设计方法。在统计试验设计的基础上建立起一项基于经验的统计学保障过程模型，并在模型验证中利用简单的统计学(残差分析)诊断对该模型进行筛选，在该步工作中经常发生目标冲突问题。将某项参数朝向有利于某一目标值方向调整时，往往会对另一目标值带来不利影响。为了稳健的进行参数的筛查及甄别，必须利用一项多目标模型。该模型中涵盖了所有参数从最小到最大的调整范围，称之为试验区间;在QbD质量源于设计的原理之中，也同样称之为知识空间。一般情况下，它比随后测定的设计空间大许多。大多数情况下，人们需要多项目标值，以便在一系列试验中达到所有的试验目的。双峰的分辨率依旧是现如今UHPLC超高效液相色谱洗脱技术中的一项最重要目标值。

　　参数筛查的试验计划

　　试验设计及QbD质量源于设计分析，是建立在含有所有参数及多目标的UHPLC洗脱模型基础之上的最有效方法，最大的问题便是：UHPLC洗脱模型优化时经常因试验条件的变化导致原来的双峰顺序发生逆转。现就旧模型中将分辨率作为目标值的问题提出两点异议：

　　第一点：A和B两个峰值改变了它们的流出顺序，一次是A先B后，另一次是B先A后。为了能够区别此两种情况需要在这两项分辨率前标上负号(例如：RS(AB)=1.5及Rs(BA)=-1.5)。

　　第二点：因试验条件的改变，试验设计计划中的实验会得到不同的双峰，这些双峰均需要作为关键双峰对待。第一项异议可归咎于DoE实验设计方法过程运用的笨拙化。若在峰值顺序发生改变时简单将其分辨率前加上负号则被称为隐式应用，其“绝对值”为零，但并没有使用绝对值函数，也没有引用绝对值函数。相反，便是另一种分辨率，仅将“分辨率>极限分辨率”与“负分辨率<负的极限值”视为等价。从洗脱质量角度看，这两点绝对等同。第二点不同意见恰恰是使用实验设计最好的论据之一。利用同一模型得到的所有双峰数据均是由同一实验计划得到的数据。在多目标值优化中使用带有负号的分辨率是为了定义与转换点具有足够安全距离的设计区间。

图2 设计空间超立方体中稳定固定相筛查时的tG-T数据图

　　结果及讨论

　　DoE实验设计方法在目标值Rs及tRmax试验中的结果请参见原始数据图。尤其值得注意的是：1-2，5-6及6-7三个双峰的分辨率。在这些双峰数据中，由于所需试验条件的变化，双峰的顺序也出现了逆变;也就是说：出现了带负号的分辨率值。6-7号双峰对应的是Triart色谱柱，5-6及6-7号两组双峰数据对应的是Kinetex XB C₁₈色谱柱，而Acquity BEH C₁₈色谱柱对应的是1-2，5-6及6-7等三个双峰(附条)。除了洗脱顺序外，关键双峰也因试验设计造成实验因子设置的改变。

图3 色谱洗脱的稳定性：稳定固定相筛查时的T-%Bs–tG-F 等参数的4D设计空间图

　　稳健的优化

　　目前，在对UHPLC超高效液相色谱技术建模过程的最佳工作点计算时，找到最接近目标值的解决方案，需使用商业的计算机辅助软件CMD[11，12，13]，而找到稳定的(全局的)工作点(参见表1)则允许在保证遵守UHPLC超高效液相色谱洗脱技术规范的前提下在设计空间中使用最大的因子变量。除此之外，也测定了适用于各种色谱柱类型的UHPLC超高效液相色谱洗脱稳定性(参见图2)。对三种UHPLC色谱柱均进行了类似的稳定工作点计算，同样遵守了所有色谱柱目标值区间(-1.5≥-Rs.krit或Rs.krit≥1.5)的规定。

　　若只考虑色谱柱最后的峰值，关键双峰Rs.krit和tRmax的分辨率质量时，则Kinetex XB C₁₈色谱柱是常规分析时最合适的洗脱色谱柱(具有足够的关键双峰分辨率，极短的分析时间)。

　　高效液相色谱分析的稳健性

　　25年前就有人提出：除关键双峰的分辨率之外UHPLC洗脱的质量评判标准还应包括洗脱的稳定性，而在UHPLC洗脱稳定性判定过程中，QbD质量源于设计的核心就是对于设计空间大小的估计。利用设计空间超立方体，一种在不规则设计空间中具有最大可能规则形的超方形(虚线覆盖的面积)则会在设计空间中的一小块二维区间t_G-T(对HPLC高效液相色谱洗脱具有最强影响)内将多因素、多目标优化的稳定结果可视化(参见图2)。

　　正如从图片中推断出来的那样：Triart C₁₈色谱柱在UHPLC洗脱中具有最大的设计空间超立方体面积，也就是说：在Triart C₁₈色谱柱中进行UHPLC洗脱最稳定。在Acquity BHT C₁₈色谱柱中，UHPLC洗脱的设计空间超立方体面积最小，表示它的洗脱稳定性最差。该事实也在4D设计空间图(参见图3)中呈现出来，图中绿色面积的大小表示T、%Bs、tG及F等最重要因素的稳定性，同样确定了根据设计空间超立方体导出的各因子公差极限(参见表2)。

　　从图3中仍可推断出：Triart C₁₈色谱柱在设计空间区域中同样具有较大的绿色区域(误差概率为1%);也就是说：色谱洗脱最稳定。在UPHLC超高效液相色谱洗脱中，Kinetex XB C₁₈色谱柱的洗脱稳定性并不好。最不稳定的UHPLC洗脱出现在Acquity BHE C₁₈色谱柱中(没有绿色)。利用设计空间超立方体的最高极限值及最低极限值可确定UHPLC超高效液相色谱洗脱中各个因子可能的公差带(参见表2)。

　　在利用Triart C₁₈色谱柱的UHPLC超高效液相色谱洗脱时，可以得到最宽的因子公差带;也就是说：每种因子均具有最大可能的变动范围(保证目标值前提下在设计空间范围内参数设置的变化)。在误差概率设定为1%的公差范围内，参数的调整设置(PAR)不得影响UHPLC超高效液相色谱洗脱质量(-1.5≥-Rs.krit或者Rs.krit≥1.5)。

图4 表示最稳定工作点以及设计空间超立方体最高、最低点的6因素DoE统计实验方法模型的Dry lab 4.0模拟色谱图

　　对于UHPLC洗脱的控制

　　在稳定工作点以及在设计空间超立方体最高与最低顶点的色谱图表明了UHPLC色谱洗脱质量。在设计空间超立方体中所有的三点中，目标特征值(-1.5≥-Rs.krit或者Rs.krit≥1.5)均得以保障。

　　如果在评判UHPLC色谱柱的质量时只考虑色谱柱最后峰值关键双峰Rs.krit和tRmax的分辨率时，则Acquuity BEH C18色谱柱是常规分析时最合适的洗脱色谱柱了(关键：双峰最佳的分辨率，短暂的分析时间)。若在评判洗脱质量时仍需要考虑UHPLC超高效液相色谱洗脱的稳定性，则Acquuity BEH C18色谱柱便是最不适合的色谱柱、Triart C18便是常规分析时最适合的色谱柱!

　　只有同时考虑所有的重要因素以及选择另一分辨率(例如，关键双峰的分辨率Rs.krit)作为目标值并在考虑了色谱洗脱的稳定性之后才能得到有说服力的UHPLC洗脱质量，并能够有目的的选择出最合适的UHPLC色谱洗脱柱，高效、稳定的在保证遵守目标特征值(-1.5≥-Rs.krit或者Rs.krit≥1.5)的前提下完成色谱洗脱。

　　小结：本文介绍的是一种评判UHPLC超高效液相色谱洗脱质量好坏的系统方法。除关键双峰的分辨率之外，也将洗脱稳定性纳入评判色谱洗脱质量标准之中。只有通过设定稳定的工作点、可靠的因子公差范围PAR及关键双峰的分辨率，才能描绘出UHPLC超高效液相色谱洗脱技术的特征。只要参数、因子都在设定的范围内变化，就无需对UHPLC色谱洗脱重新进行验证。

　　本文作者Hans-Werner Bike先生系Brannenburg市，LC-Pharm公司HPLC高效液相色谱技术服务专家;Andreas Orth先生是法兰克福市，法兰克福大学应用科学系教授。

来源：实验与分析