RRLC-UV/MS建立可靠的中药质控方法

2018-05-29 11:10:36

我国拥有长期使用中药和中药制剂的历史，中药一直未能得以飞速发展的主要原因是缺乏科学的质量控制标准。如今，对中药的质量控制仅局限于外观检查是远远不够的。随着新技术的发展，研究人员已经发现某些中药中有几百种化合物，其浓度范围很宽，而且由于产地和采摘时期不同，以及炮制和加工工艺不同，中草药的成分也各不相同。因此，对中药化合物的质量控制极具挑战性。由于特殊配方的中药制剂通常是由多种中药组成，因此只测定中药制剂中一两种成分进行质量控制已无法满足要求。例如用于治疗冠心病的中成药芪参益气滴丸，就包含黄芪、丹参、三七和降香4种中药。

本研究以芪参益气滴丸为样品，用高分离度快速液相色谱(RRLC)-紫外-可见检测器和质谱联用，建立中药质量控制的新方法。主要目标是建立一种可靠的方法，能够选测定在加热和混合过程中不变的潜在目标化合物。

实验内容

实验仪器

Agilent 1200系列RRLC系统包括：带真空脱气机的SL型二元泵、SL型高性能自动进样器、配置微量流通池(2µl体积，3mm光程)的SL型柱温箱和二极管阵列检测器SL;

Agilent 6410四极杆质谱仪，配置ESI离子源;

Agilent 化学工作站B.02.01SR，用于数据采集和分析;

Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色谱柱，3.0×50mm, 1.8µm粒径。

标准品

丹酚酸B、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参素、三七皂甙R1和黄芪甲苷均购自中国药品生物制品检定所(NICPBP)，人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1、原儿茶醛、原儿茶酸、人参皂甙Re和人参皂甙Rc 购自Sigma-Aldrich公司(美国)。

溶剂

乙腈购自Fisher公司(美国)，水由Milli-Q纯水系统制备。

样品和样品制备

芪参益气滴丸、黄芪、丹参、三七的中间提取物，及降香精油，由中国TASLY制药公司提供。原药材购自当地中药店。滴丸、中药提取物和中药原料溶于70%甲醇/水溶液中，超声提取30min，用0.22µm滤膜过滤。

RRLC方法

流动相A：0.1%甲酸水;流动相B：乙腈，含0.1%甲酸;

梯度：0min，10%B;8min，38%B;12min，100%B;持续3min，然后10%B;

流速： 1.0ml/min(被动分流器将进入MS的流速降至0.4ml/min);

柱温：45℃;检测波长：203nm;峰宽：0.5s;狭缝宽度：4nm;光谱：190~400 nm，2nm步进。

质谱方法

扫描：80~1400(正/负);碰撞诱导解离电压：70(正/负);干燥气体：12L/min;

雾化器压力：50psi;干燥气温度：50℃;毛细管电压：3200 V(正/负)。

结果与讨论

用安捷伦方法转换计算器(光盘发行号5989-5130EN)将常规液相色谱方法转换成高分离度快速液相色谱方法。

丹参三七黄芪和降香提取物的比较

由图1可见，在203nm检测波长下，丹参和三七的色谱图与混合提取物有很大区别。混合和加热后，某些峰消失了，同时出现了一些新的色谱峰。目标化合物筛选是质量控制的重要步骤，可以确定加工过程中这些化合物是否发生了变化。大多数研究者都用203 nm进行检测，因为主要活性化合物是皂甙，在203 nm波长下有弱吸收。但203 nm处的大峰可能与质量控制无关，那些小峰可能对研究活性成分更重要。因此，需要另一种灵敏度更高的检测器，提供这些成分的更多信息。

图1. 各中药丹参、三七及混合提取物的色谱图。

不同检测器和条件之间的比较

图2显示了紫外和MS检测的不同结果。

在MS的总离子色谱图中有更多的峰，因为某些成分紫外吸收很弱或者没有吸收。用MS检测增加了另一维数据，并得到了这些不同化合物的结构信息。负离子模式给出了这些峰更完整的信息，可以对质量控制的目标化合物进行鉴定。

芪参益气滴丸和不同提取物之间的比较

图3显示了丹参、黄芪和降香提取物与芪参益气滴丸(由这3种提取物和其它填加剂制成)的色谱图。标记数字的峰就是对这一中药制剂质量控制筛选到的目标化合物。根据UV和MS数据，研究不同的色谱峰，以确定这些化合物是否发生了改变，,鉴别结果如表1所示。

图3. 三种中药组合及滴丸样品的负离子TIC比较。

表1. 目标化合物的结构式和检测信息

色谱峰	化合物	MS	UVλ_ma×(nm)
1	丹参素	197 [M–H]^–, 395 [2M–H]^–	280
2	隐丹参酮	137 [M–H]^–, 275 [2M–H]^–	225，280，310
3	丹酚酸 B	717 [M–H]^–	260，280
4	人参皂甙 Rg1	845 [M+HCOO]^–	210
5	人参皂甙 Rb1	11071[M–H]^–	210
6	黄芪甲苷 IV	829 [M+HCOO]^–	210
7	丹参酮 I	295137 [M+H₂O]^–	230