把液相做的如“打游戏”? 做液相色谱不可不知的经验谈

2018-05-29 11:06:56

　　液相色谱仪可以说是药物分析工作者最常使用的“一门武器”。何时能做液相做的如“打游戏”一般时，才算是到了游刃有余、庖丁解牛的境界。现如今的液相色谱软件均已具备了强大的数据处理功能，如能运用自如，可达事半功倍之效。

　　水相中溶质的溶解

　　水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式。因为振摇、超声有可能使得溶质处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形(如遇有机溶剂、温度剧降等)，极易析出结晶，损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白粉”的现象。

　　流动相的配制与使用

　　恒度洗脱

　　将水相与有机相混合后、使用混合型过滤膜抽滤，用一个管路(如A管)泵入仪器，这是基本原则。若使用两个管路(一个纯水相、一个纯有机相)泵入仪器，极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。剩余的流动相可继续使用，需密封后放置于阴凉处，待下次实验时与新配制的流动相混合后使用。无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题。因为实践证明这些担心是多余的，一定要多实践，多总结!

　　梯度洗脱

　　流动相最为科学的配制方式如下：一、A相为高比例水相-低比例有机相，B相为低比例水相-高比例有机相(英国药典如此规定);二、A相为高比例水相-低比例有机相，B相为纯有机相。最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，这会导致基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。

　　梯度洗脱结束后，建议经5min后回到初始状态，再稳定5min后开始下一测定。这10min的稳定极为关键，切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱造成损害。一周内，对梯度洗脱进行连续试验，结果是：第一针与最后一针主成分保留时间相差均小于6s。

　　色谱柱的安装

　　标准操作规程(SOP)应为：取A管路放入流动相瓶中 → 拧松泵头 → 流速由0ml/min逐渐升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出(持续10秒) → 拧紧泵头 → 流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出(观测是否呈抛物线状，持续5秒) → 流速逐步降至1.0ml/min → 安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端 → 手握两端螺丝帽，拧紧。以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液。

　　试验后色谱柱的清洗

　　最为常用的C8柱、C18柱

　　当流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时，流速1.0ml/min冲洗30min，，柱温保持实验时的温度;水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时，先采用纯水(或含有2%甲醇)，冲洗A管路(实验中采用的管路)，时间30min(如流动相中有表面活性剂，则适当增加时间)，流速1.0ml/min，柱温可较实验温度高出5~10℃;随后更换成20%甲醇再冲洗30min，流速不变，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。

　　实践证明没必要采用高比例的甲醇冲洗，因为残余有机相中的水相遇到高比例甲醇后在泵头上、色谱柱中会析出少量盐和表面活性剂，导致色谱柱寿命缩短。

　　其他类型色谱柱

　　对于不经常使用的色谱柱类型，最好先查询使用、清洗、保存的方法，不能凭感觉操作，否则易造成色谱柱性能急剧下降的后果。

　　试验顺序

　　工作流程如下进行：

　　(1) 0~2h,配制流动相、对照品和供试品溶液等;

　　(2) 2~3h,采用A管路注入流动相(B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路)，平衡1h。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0ml/min，平衡1h后即可开始检测;

　　(3) 3~5h,测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始检测样品。所谓“不漂移”，通常指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定过小，会使杂质峰显得很突兀，导致基线不稳;

　　(4) 5~8h,配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。勿设定为切换至B管路洗脱;

　　(5) 9~24h,放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定样品采取“即配即测”方式。充分利用下班后的16h，做到从容不迫、镇定自若。如尚未配制自动进样，建议向领导申请购买，一台自动进样等于三台手动进样;

　　(6) 第二天0~0.5h,检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30min后，测定重新配制的该样品即可(同时回校对照一针)。无需全部重新测定，无需过度谨小慎微;

　　(7) 第二天0.5~2.0h,如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。